Proteolytic Processing as a Regulator of BMP-type Signaling in Drosophila Development

A small set of highly conserved signaling molecules performs a great number of tasks in different animals and developmental contexts. Among them, the bone morphogenetic proteins (BMPs) constitute a group of growth and differentiation factors that are involved in numerous developmental processes affecting cell proliferation, apoptosis and differentiation. In the fruit fly, Drosophila melanogaster, three BMP type proteins have been identified, each of which has a homolog in mammals. Decapentaplegic (Dpp) is a BMP2/4 type protein which plays a major role in dorsal-ventral patterning of the early embryo. It participates in midgut development, patterning and growth of imaginal tissues, wing vein formation and maintenance of germline stem cells in the germarium. Dpp is a morphogen which requires a second BMP type protein, Screw (Scw) or Glass bottom boat (Gbb) to be able to form proper concentration gradients in developing tissues. Scw and Gbb belong to the BMP5/6/7/8 subfamily and their expression domains are different; Scw is specifically expressed during the early events of embryogenesis, while Gbb has more functional roles during later stages of fly development, like wing morphogenesis. BMP type proteins are produced as large proproteins that require proteolytic cleavage prior to secretion and extracellular gradient formation. This study concentrated on the cleavage of Dpp and Scw to reveal the meaning of post-translational modifications in concentration gradient formation and BMP signaling. Three furin recognition sites were identified in the Dpp proprotein. Mutational analyses indicate that the upstream optimal furin site of the prodomain (furin site (FS) II) is critical for producing ligands and creating a long range concentration gradient in a wing imaginal disc. Cleavage of the other two FSs produce the differently sized Dpp ligands that contribute to BMP gradient formation in the early embryo and wing imaginal disc. It was noted that the cleavage requirements of BMP2/4 type proteins in different species vary to establish species-specific regulation of BMP signaling. Discovery of the scwE1 allele, that causes dominant negative effect in embryos heterozygous for a hypomorphic dpp allele, gave more information about how the cleavage patterns of prodomains can contribute to creating diversity in the regulation of signaling. The mutation responsible for the dominant negative function in scwE1 was located in the cleavage site that is in the prodomain of Scw. Mutational analyses showed that the mature ligand of ScwE1 is produced in lower amounts and in complex with an N-terminal prodomain peptide. ScwE1 preferentially binds Dpp and disrupts normal gradient formation possibly through interactions with molecules within the extracellular matrix. Phylogenetic analyses and functional studies of BMP cleavage mutants propose a mechanism by which post-translational regulation of proproteins modulates BMP signaling.Yksi tärkeimmistä kysymyksistä kehitysbiologian alalla liittyy kudosten erilaistumista ja kokoa määrittävien proteiinien toimintamekanismeihin. Miten pieni joukko proteiineja pystyy määrittämään niin monien erilaisten eläinten ja kudosten kehittymisen suunnan? Luun morfogeneettisillä proteiineilla (BMP) on tärkeä rooli alkionkehityksen aikana. Ne vaikuttavat solujen kykyyn lisääntyä, erilaistua ja kuolla. Banaanikärpäsen kehitykseen vaikuttaa kolme BMP-tyyppistä proteiinia, joiden vastineet nisäkkäissä ovat rakenteellisesti ja toiminnallisesti hyvin samankaltaisia. Decapentaplegic (Dpp), joka luokitellaan BMP2/4-tyyppisten proteiinien alaluokkaan, määrittää banaanikärpäsen kudosten kehityssuunnan jo silloin kun alkio on yksi monitumainen solu. Yhteistyössä BMP5/6/7/8-proteiiniluokkaan kuuluvan Screwn (Scw) kanssa Dpp muodostaa alkiossa selkäpuolen keskiviivaa kohti voimistuvan pitoisuusgradientin. Dpp-pitoisuus määrittää solujen sijainnin ja identiteetin alkiossa ja ohjaa kohdegeenien ilmentämistä. Näin Dpp:n ja Scw:n aiheuttaman BMP-signaalin voimakkuus ohjaa kudosten erilaistumista. Scw-proteiinia ilmennetään vain alkion varhaiskehityksen aikana, jonka jälkeen sen rooli BMP-signaalin korostajana korvataan toisella BMP5/6/7/8-tyyppisellä proteiinilla, Glass bottom boatilla (Gbb). Dpp:llä ja Gbb:llä on merkittävä rooli mm. siiven rakenteen määrittämisessä. BMP-tyyppiset proteiinit ovat isoja, inaktiivisia pro-proteiineja ennen kuin ne pilkkoutuvat furiinin tapaisten proteaasien toimesta. Tämä prosessi on yksi tapa säädellä proteiinin toimintaa, mutta tarkempi tutkimustieto pilkkomisen vaikutuksista alkionkehitykseen puuttui. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään miten Dpp- ja Scw-pro-proteiinien pilkkominen vaikuttaa pitoisuusgradientin muodostumiseen ja BMP-signaalin muodostumiseen. Dpp-pro-proteiinista löydettiin kolme furiinin pilkkomiskohtaa. Dpp:n prodomeenin alueella sijaitseva furiinin tunnistuskohta (FS) II osoittautui tärkeäksi ligandien tuoton kannalta. Proteiinit, joiden FSII-kohdan pilkkominen on estetty pistemutaatioilla, eivät kykene muodostamaan pitoisuusgradienttia siiven imaginaalilevyssä. Kaksi muuta pilkkomiskohtaa (FSI, FSIII) vastaavat kahden erikokoisen Dpp-ligandin tuotosta. scwE1-alleelin löytyminen toi lisää tietoa siitä, miten proteiinien proteolyyttinen pilkkominen voi luoda monimuotoisuutta BMP-signaloinnin säätelyyn eri eläimillä. Tämän dominantin alleelin aiheuttaman BMP-signaloinnin laskun todettiin johtuvan prodomeenin pilkkomiskohdassa sijaitsevasta pistemutaatiosta. Analyysit osoittivat, että kypsän ligandin tuotto romahtaa mutaation takia ja Scw eritetään soluista yhtenä kompleksina prodomeeninsa kanssa. Tämä kompleksi muodostaa heterodimeerejä Dpp:n kanssa ja estää BMP-signaaligradientin muodostumisen. BMP-tyyppisten proteiinien erilaisten pilkkomiskohtien todettiin tuovan lisää lajikohtaista monimuotoisuutta signaloinnin säätelyyn