Physcomitrella patens as a model for studies on plant-pathogen interactions

Mosses (Bryophyta) are among the basal embryophytes, which constitute a large part of the photosynthesizing biomass and carbon storage on Earth. Albeit inhabited by a number of fungal species, little is known about how this important portion of flora maintains its health status. Vascular plants (tracheophytes) respond to micro-organisms by the production of reactive oxygen species (ROS), the activation of signaling cascades leading to altered gene expression, protein synthesis and the secretion of extracellular proteins and metabolites. But how do mosses respond to pathogens and pathogen elicitors? The aim of this study was to understand interactions between mosses and fungal pathogens by finding out how the moss Physcomitrella patens responds to a fungal cell wall -derived compound chitosan, which induces defense in vascular plants, by identifying the genes involved in the response and determining their significance against fungal pathogens by creating knockout plants. Chitosan treatment was used to study the production of ROS, extracellular enzyme activity, the expression of defense gene homologs of vascular plants and the changes in the extracellular proteome of P. patens. The resulting information was utilized to generate knock-out moss plants, and since natural pathogens of P. patens are not known, the responses of the knock-out moss plants were tested using fungi isolated from commercially grown Sunagoke moss Racomitrium japonicum. The pathogenicity of these fungi was tested also on selected vascular plants. Chitosan caused the generation of superoxide and a rapid increase in peroxidase activity resulting from a single peroxidase (Prx34) of P. patens. The induction of genes related to oxidative stress and defense signaling was observed. Proteomics studies of extracellular proteins revealed secretion of a large number of proteins in response to chitosan treatment. Fungal infection in P. patens induced the formation of papillae, cell wall reinforcement, chloroplast repositioning, spreading necrosis and a reaction reminiscent of a hypersensitive response. The ΔPrx34 mutants of P. patens were susceptible not only to pathogenic but also to saprophytic fungi. The previously described salt sensitive ΔPpTSPO1 mutants of P. patens, lacking the PpTSPO1 gene involved in mitochondrial tetrapyrrole transport and abiotic (salt) stress tolerance, also showed enhanced susceptibility to fungal infection. Certain fungi including Cladosporium oxysporum and Fusarium avenaceum isolated from disease lesions in Sunagoke moss could also infect P. patens and vascular crop plants. The studies pointed out Prx34 as the first specific host factor that is pivotal for pathogen defense in a bryophyte. PpTSPO1 appears as a new link between abiotic and biotic stress signaling and illustrates the importance of redox homeostasis required for efficient pathogen defense. Analysis of extracellular proteins of P. patens indicates an active basal defense towards fungi and expands the current knowledge of bryophyte secretory proteins. Furthermore, results suggest that mosses and vascular plants may be linked by a common microbial interface consisting of pathogenic fungi. These findings have implications that have gained little previous attention.Sammalet ovat ekologisesti tärkeä kasviryhmä etenkin pohjoisella pallonpuoliskolla, esimerkiksi hiilinieluina ja estämässä metsänpohjan eroosiota. Vaikka tiedetään, että sammalissa elää useita sienilajeja, on epäselvää, kuinka sammalet puolustautuvat näitä mahdollisesti haitallisia mikro-organismeja vastaan. Tutkimuksemme tarkoituksena oli selvittää, kuinka molekyylibiologian mallikasvina käytetty nuppusammal (Physcomitrella patens) reagoi kitosaaniin, taudinpuolustusta aktivoivaan sienisoluseinän rakenneosaan, ja tutkia näiden reaktioiden merkitystä taudinpuolustuksessa poistogeenisten sammalkasvien avulla. Koska nuppusammalen luonnollisia sienipatogeenejä ei tunneta, tartutuskokeissa käytettiin Japanissa kaupallisesti viljellyltä Sunagoke-sammalelta (Racomitrium japonicum) kuvaamiamme sienitaudin aiheuttajia. Näiden joukosta löydettiin myös putkilokasvien tunnettuja sienipatogeenejä. Vaikka sammalilta ja putkilokasveilta on aiemminkin löydetty samoja sienilajeja, sammalilta eristettyjen sienten kykyä tartuttaa putkilokasveja ei ole ennen tutkittu. Tietyt Sunagoke-sammalelta eristetyt sienipatogeenit pystyivät nuppusammalen lisäksi infektoimaan myös viljelykasveja, mikä antaa uuden näkökulman kasvitautien epidemiologiaan. Kun nuppusammalta käsiteltiin kitosaanilla, kasvatusalustan peroksidaasiaktiivisuus kasvoi. Erittyvän Peroksidaasin aminohapposekvenssi selvitettiin, ja kyseistä proteiinia koodaava geeni poistettiin sammalen genomista geenitekniikan keinoilla. Peroksidaasimutantit eivät olleet herkempiä ainoastaan taudinaiheuttajasienelle vaan myös ei-patogeeniselle lahottajasienelle, mikä osoitti peroksidaasin olevan tärkeä osa sammalen taudinpuolustusta. Näin osoitimme ensimmäisen tunnetun sammalen taudinpuolustusmekanismin poistogeenisten sammalkasvien avulla. Koska ympäristön ja patogeenien aiheuttamat solutason stressivasteet ovat osittain samankaltaisia, tutkimme aiemmin kuvattujen suolaherkkien mutanttisammallinjojen vasteita sieni-infektioon. Tässä tutkimuksessa saimme selville, että yllämainittua peroksidaasia tarvitaan happiradikaalien tuottoon. Suolaherkät sammallinjat tuottivat kontrollikasveja enemmän happiradikaaleja, mutta olivat silti herkempiä sienitaudeille, mikä osoittaa happiradikaalien määrän säätelyn merkityksen onnistuneessa sammalen puolustusreaktiossa. Peroksidaasin lisäksi putkilokasvien tiedetään erittävän useita proteiineja, mutta sammalten erittyviä proteiineja ei juuri tunneta. Selvitimme sammalen nestemäiseen kasvualustaan erittämiä proteiineja modernin massaspektrometrian avulla. Kaiken kaikkiaan tunnistimme kasvatusalustasta yli 400 erittyvää proteiinia, joista 70 % oli homologisia putkilokasvien erittyvien proteiinien kanssa. Kitosaanin lisäys kasvatusalustaan sai aikaan uusien proteiinien erittymistä ja proteiinien määräsuhteiden muutoksia. Tunnistetut proteiinit tarjoavat laajan aineistopohjan tulevien tutkimusten tarpeisiin