Defining the quantitative aspects of dominant tolerance induction and maintenance

Tese de doutoramento, Ciência Biomédicas (Imunologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013Immune tolerance is a state of unresponsiveness towards a set of antigens while remaining fully competent to mount unrelated immune responses. The immune system is usually tolerant to our own antigens (self), to food antigens (oral tolerance), and to several other foreign substances to which we are regularly exposed (such as pollens and other potential allergens). However, under certain conditions, either genetic or environmental breakdown of tolerance towards specific antigens can occur. This will originate the onset of autoimmune and allergic pathologies. On the other hand, the correct functioning of the immune system can lead to rejection of vital transplants as graft antigens are perceived as foreign antigens thus resulting in a poor clinical outcome. Despite recent advances, most current treatments for immune pathologies still aim to downmodulate immunity and inflammation, rather than to reestablish the healthy state of immunological tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are key players in the induction and maintenance of peripheral tolerance, having an essential role in preventing transplant rejection and also allergic responses. Nonetheless, the molecular mechanisms by which they mediate suppression are still obscure, and their investigation is a current priority, as it may reveal important targets for immune intervention. Also, several studies point to other mechanisms that are important for tolerance induction, namely activation induced cell death (AICD) and other regulatory cell subtypes. Studies in mouse models show that a short-term therapy with monoclonal antibodies (MAbs) targeting key lymphocyte molecules is capable of producing long‐term tolerance. This concept became known as reprogramming of the immune system or therapeutic tolerance induction. Non-depleting anti-CD4 monoclonal antibodies (MAbs) were shown efficient in inducing long-term dominant tolerance mediated by regulatory T cells in several animal models of transplantation, allergy, and autoimmunity. However, despite many studies on tolerance induction following CD4- blockade, the consequences of this intervention on T cell kinetics and consequently on tolerance induction still remain to be elucidated. X | In this thesis I describe my studies of tolerance induction achieved through the use of non-depleting anti-CD4 MAb. Not only did I study Treg induction but also mechanism that contribute to establishment of the healthy state of tolerance. First of all, we have found that in vitro suboptimal T cell activation results in induction of Foxp3 expression, in the absence of exogenous TGF-β. The frequency of conversion in these cell cultures is similar to that which we found in vivo upon anti- CD4-induced transplantation tolerance. Besides that, we showed that TCR triggering with low-dose anti-CD3 or low-dose agonist peptide promotes TGF-β production by T cells. This effect was also observed with downmodulation of the TCR signal with nondepleting anti-CD4. TGF-β production by T cells is an event that precedes Foxp3 expression and is Foxp3 independent. Moreover, we confirmed that Foxp3 induction led to regulatory function in these cells as they were able to inhibit the proliferation of effector T cells. These findings support the view that sub-immunogenic regimens lead to dominant tolerance as a result of T-cell intrinsic properties. Secondly we took an interdisciplinary approach to analyzing lymphocyte dynamics, taking advantage of mathematical models that have been shown useful to estimate rates of proliferation and cell death following an intervention. Using the same strategy we studied the dynamics of T cell activation under the cover of non-depleting anti-CD4 MAb. We found that non-depleting anti-CD4 MAb prevents CD4+ T cells from undergoing optimal proliferation and lead to a higher frequency of apoptosis, even before any significant induction of Foxp3. Although the dynamic changes we detected are small, during the course of a proliferative response they lead to a very distinct overall outcome in terms of final cell numbers. The importance of these mechanisms predicted from the mathematical models for the overall tolerance was confirmed by showing that lck-driven Bcl-xL transgenic mice, bearing T cells resistant to apoptosis, fail to become tolerant to skin grafts following CD4-blockade. Our data show that in addition to induction of regulatory T cells, CD4 blockade has a marked effect in the kinetics of the effector T cell pool by the combined action of hindering proliferation while favoring apoptosis. Finally, we compared two well-established models of tolerance induction using non-depleting anti-CD4 MAb. We were able to induce tolerance with anti-CD4 preventing allergy and skin graft rejection. Although transplantation tolerance is dependent on Foxp3+ Treg cells that does not seem to be the case with allergic sensitization, as the treatment of mice that cannot produce Foxp3+ Treg cells still leads to tolerance. We found that tolerance induced with non-depleting anti-CD4 MAb in a model of allergy relies both on AICD and IL-10 as this cytokine was proven essential to tolerance induction. Moreover, the prevention of skin graft rejection also relies on IL- 10 and AICD. Nevertheless, tolerance induction with skin transplant and non-depleting anti-CD4 MAb can prevent eosinophilia (a key feature of allergy), but more remarkably tolerance induction with OVA-Alum and non-depleting anti-CD4 MAb can sustain a skin graft long-term, even though it is independent of Treg cells. Altogether, this thesis represents an advance in our understanding of the conditions that promote tolerance induction with non-depleting anti-CD4 MAb. We analyzed the effect of suboptimal stimuli to CD4+ T-cells, the kinetics of CD4+ T-cell activation in the presence of anti-CD4 MAb and compared different antigen delivery methods (local vs. systemic). Our results point to defects of CD4+ T-cell activation, both qualitative and quantitative, as key to the tolerance induction protocol.Tolerância imunitária é o estado em que não ocrre resposta agressiva a um determinado conjunto de antigénios, permanecendo o sistema imunitário competente para responder contra outros antigénios diferentes. Em geral, o sistema imunitário é tolerante aos nossos próprios antigénios, antigénios alimentares (tolerância oral) e outros antigénios aos quais estamos normalmente expostos (tal como pólens e outros potenciais alergénios). Contudo, em determinadas condições genéticas ou ambientais pode ocorrer uma quebra de tolerância em relação a um determinado antigénio. Esta quebra na tolerância irá originar patologias autoimunes ou alérgicas. Por outro lado, o correcto funcionamento do sistema imunitário pode levar à rejeição de transplantes, já que os antigénios do tecido transplantado são reconhecidos como estranhos, o que conduz à sua eliminação. Apesar de desenvolvimentos recentes, a maioria dos tratamentos existentes para patologias onde ocorre uma quebra da tolerância imunitária ainda procuram diminuir de um modo não específico a imunidade e inflamação, em vez de reestabelecer o estado saudável de tolerância. As células T reguladoras (Treg) são essenciais na indução e manutenção da tolerância periférica, tendo um papel fundamental tanto na prevenção de rejeição de transplantes como no controlo de respostas alérgicas. No entanto, o mecanismo molecular através do qual as células Treg medeiam a supressão imunitária ainda não é completamente conhecido. Uma melhor compreensão dos mecanismos de imunorregulação é uma prioridade, pois pode levar à descoberta de alvos terapêuticos importantes para intervenções moduladoras do sistema imunitário. Além das células Treg, alguns estudos sugerem que outros mecanismos reguladores são igualmente importantes para indução de tolerância imunitária. É o caso da morte celular induzida por activação (AICD) de células T, ou a acção de outros tipos de células com função reguladora, nomeadamente células reguladoras produtoras de IL-10 (Tr1). Estudos em animais demonstraram que uma terapia de curta duração com anticorpos monoclonais (MAbs), que tenham por alvo moléculas chave da activação dos linfócitos T, é capaz de induzir tolerância a longo prazo. Este conceito ficou conhecido como a reprogramação do sistema imunitário ou a indução terapêutica de tolerância. Mostrou-se, em vários modelos animais de transplantação, alergia e autoimunidade, que anticorpos monoclonais não depletantes contra CD4 são eficientes na indução, a longo prazo, de tolerância imunitária dominante mediada por células T reguladoras. Contudo, não são inteiramente conhecidas as consequências deste bloqueio na dinâmica das células T e, consequentemente, o seu papel na indução de tolerância imunitária. A presente tese descreve estudos em indução de tolerância através do recurso ao anticorpo monoclonal não depletante contra CD4. Para além de estudar a indução de Tregs, estudei também os mecanismos que contribuem para estabelecer um estado saudável de tolerância, nomeadamente o impacto nas células efectoras que não são convertidas em Treg. Em primeiro lugar, descobrimos que estimulação sub-óptima in vitro resulta na indução da expressão de Foxp3 em células T, mesmo sem adicionar TGF-β exógeno. Nestas culturas celulares, a frequência de células que são convertidas em Treg é semelhante à frequência observada in vivo após a indução de tolerância a um transplante de pele com anti-CD4. Mostrámos ainda que a estimulação do receptor de célula T (TCR) com pequenas doses de um péptido agonista do TCR ou anticorpo monoclonal não depletante anti-CD4 promove a produção autóloga de TGF-β. Esta produção de TGF-β pelas células T é um acontecimento que precede e é independente da expressão de Foxp3. Confirmámos também que a indução de Foxp3 nestas células resultou numa função reguladora, já que as células Foxp3+ foram capazes de inibir a proliferação de células T efectoras. Estes resultados estão de acordo com a ideia de que regimes sub-imunogénicos originam tolerância dominante como consequência de propriedades intrínsecas das células T. Em seguida adoptámos uma abordagem interdisciplinar, com recurso a modelos matemáticos, para analisar a dinâmica linfocitária. Este tipo de modelos teóricos tem sido muito importante no estudo e compreensão da dinâmica linfocitária, nomeadamente estimando taxas de proliferação e morte celular em diferentes condições experimentais (tanto in vitro como in vivo). Usando a mesma estratégia, estudámos a dinâmica de activação das células T sob o efeito do anticorpo monoclonal não depletante contra CD4. Descobrimos que este anticorpo monoclonal impede alguma proliferação das células T CD4+ e, simultaneamente, aumenta a frequência da apoptose destas células. As alterações que detectámos são pequenas, mas no decorrer de uma resposta proliferativa, o resultado final em termos de número total de células é bastante distinto. Isto é, quando as culturas são tratadas com anti-CD4, o total de células efectoras é muito inferior ao número de células resultantes de uma resposta imunitária sem a presença deste anticorpo. A importância global destes mecanismos, previstos pelos modelos matemáticos, na tolerância imunitária foi confirmada num modelo de transplantação de pele in vivo. Os transplantes de pele foram rejeitados em animais transgénicos para Bcl-xL tratados com anti-CD4, demonstrando uma falha na indução de tolerância, que não ocorre em animais wildtype. Nos animais transgénicos, o gene Bcl-xL encontra-se sob o controlo do promotor lck, que é específico da linhagem de células T, o que leva a que as células T destes animais resistam à apoptose. Os nossos resultados mostram que, para além da indução de células T reguladoras, o bloqueio do co-receptor CD4 tem um efeito pronunciado na população de células efectoras através do impedimento da proliferação celular e favorecimento da apoptose. Por último, comparámos dois modelos bem estabelecidos de indução de tolerância através do uso de anticorpo monoclonal não depletante contra CD4. Com recurso a este anticorpo induzimos tolerância imunitária que levou à prevenção de alergia e de rejeição de transplantes de pele. Apesar da tolerância em transplantação ser dependente de células T reguladoras Foxp3+, este não parece ser o caso na sensibilização alérgica. Nas nossas experiências, descobrimos que o tratamento com anti-CD4 de animais que não conseguem produzir células T reguladoras Foxp3+ conduz à indução de tolerância num modelo de alergia. Descobrimos também que a indução de tolerância em alergia depende de AICD de células efectoras e da citocina IL-10, já que tolerância não é induzida em animais deficientes em IL-10. Verifiquei ainda que a prevenção da rejeição dos transplantes de pele também necessita de morte celular induzida por activação e IL-10. Em conclusão, esta tese representa uma contribuição para o conhecimento das condições que promovem a indução de tolerância imunitária. Analisámos o efeito da estimulação subóptima de células T CD4+, a cinética de activação das células T CD4+ na presença de anti-CD4 e comparámos diferentes locais de apresentação de antigénio (local vs. sistémica). Os nossos resultados mostram a importância de defeitos na activação das células T CD4+, tanto qualitativos como quantitativos, como um processo crucial nos protocolos de indução de tolerância imunitária.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/35786/2007