Estudis funcionals de la disferlina i aproximacions terapèutiques en un model murí de miopatia per dèficit de disferlina

Les disferlinopaties són un grup de distròfies musculars causades per mutacions al gen DYSF. El gen DYSF codifica per la proteïna disferlina, la qual s'expressa en diversos teixits però és especialment important en el múscul esquelètic i en els monòcits/macròfags. En aquesta tesi doctoral els objectius principals eren l'estudi de les funcions de la disferlina mitjançant l'estudi de les seves interaccions amb altres proteïnes, el desenvolupament de tests per evaluar les funcions de la disferlina i l'estudi del trasplantament de moll d'os com a possible teràpia cel·lular per les disferlinopaties. Es varen estudiar les interaccions de la disferlina mitjançant una combinació de tècniques de forma novedosa. Primer es va estudiar el complex de la disferlina mitjançant l'electroforesi no desnaturalitzant o tècnica del Blue Native. També es varen determinar interaccions amb la disferlina mitjançant assaigs d'immunoprecipitació. Combinant aquestes dues metodologies, hem pogut identificar membres ja coneguts del complex de la disferlina com ara la proteïna Trim72/MG53 i la caveolina-3 i hem pogut identificar nous membres del complex, com ara la proteïna motora dineina citoplasmàtica, la calseqüestrina-1 o la miomesina-2. Per últim, es va estudiar si les proteïnes identificades com a membres del complex de la disferlina interaccionaven directe o indirectament amb aquesta mitjançant la tècnica de FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy- Fluorescence Resonance Energy Transfer). Gràcies al FLIM-FRET hem descrit el tipus d'interacció entre diverses proteïnes del complex i la disferlina, determinant que aquesta interacciona directament amb la calseqüestrina-1, la miomesina-2 la dineina i el trim72/MG53, i hem descrit com a indirecte la interacció entre la disferlina i la caveolina-3. Això ens a dut a relacionar la disferlina amb funcions en la regulació del calci per part del reticle sarcoplàsmic, l'estabilitat de les miofibretes i el tràfic de vesícules. Per altra banda em desenvolupat diferents metodologies per tal d'avaluar el correcte funcionament de la disferlina in vitro tant en miotubs com en macròfags. Per avaluar la correcta funció de la disferlina en miotubs hem posat a punt un assaig de lesió de membrana basat en l'ús de SDS, després del qual hem pogut observar, que en absència de disferlina s'acumula el marcador lisosomal Lamp-1 a la membrana, i les cèl·lules deficients en disferlina presenten una major permeabilitat al iodur de propidi. A l'estudiar l'efecte de la falta de disferlina en el macròfags varem observar que la falta d'aquesta proteïna causa que aquest tipus cel·lular es mogui mes ràpidament in vitro. Per últim, hem comprovat que el trasplantament de moll d'os en un model murí de disferlinopatia amb cèl·lules d'un donant amb expressió de disferlina normal restaura l'expressió de disferlina en els monòcits/macròfags però no en el teixit muscular. També hem comprovat que això comporta una millora funcional en aquest model murí, tot i que també varem observar certa millora en els animals autotrasplantats. Per tant, en aquest estudi concluïm amb noves interpretacions de les funcions de la disferlina basant-nos en els nous membres del complex de la disferlina identificats en els nostres estudis. Per altra banda, descrivim l'efecte beneficial per se del trasplantament de moll d'os en un model murí de disferlinopatia així com la major milloria en aquells animals en els quals s'ha restaurat l'expressió de disferlina en sang perifèrica.Dysferlinopathies are a group of muscular dystrophies caused by mutations in the DYSF gene. The DYSF gene encodes the protein dysferlin, which is expressed in several tissues but is essential in skeletal muscle and monocytes / macrophages. The main objectives in this study were to determine the functions of dysferlin by studying its interactions with other proteins, developing tests to evaluate the functions of dysferlin, and studying bone marrow transplantation as a possible cell therapy for dysferlinopathies. We studied the interactions of dysferlin using a combination of techniques in a novel way. First, we studied the dysferlin complex by Blue Native electrophoresis. We also determined dysferlin interactions with immunoprecipitation assays. Combining these two methods, we identified already known members of the dysferlin complex such as the proteins Trim72/MG53 and caveolin-3, and we identified new members of the complex, such as motor protein cytoplasmic dynein, calseqüestrin-1 and myomesin-2. Finally, we studied whether the proteins identified as members of the dysferlin complex interacted directly or indirectly by means of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FLIM-FRET) analysis. Using the FLIMFRET technique, we described the type of interaction between the proteins constituting the dysferlin complex, determining that dysferlin interacts directly with calseqüestrin-1, myomesin-2, dynein and trim72/MG53 and we described the interaction between dysferlin and caveolin-3 as an indirect interaction. This led us to hypothesize about the functions of dysferlin in the regulation of calcium from the sarcoplasmic reticulum, in the stability of myofibres, in and vesicle trafficking. In addition, we developed methodologies to determine the function of dysferlin in myotubes and macrophages in vitro. We developed a membrane injury test based on the use of SDS in myotubes. We observed that in the absence of dysferlin the lysosomal marker Lamp-1 accumulates in the subsarcolemma region, and that dysferlin-deficient cells show a higher permeability to propidium iodide. When we studied the effect of the absence of dysferlin in macrophages we observed that the lack of this protein causes these cells to move faster in vitro. Finally, we found that bone marrow transplantation in a mouse model of dysferlinopathies with dysferlin positive cells restores the expression of dysferlin in monocytes / macrophages, but not in skeletal muscle. We have noted that this implies a functional improvement in this mouse model, although we also observed some improvement in animals transplanted autologously. This study concludes by providing new insights into dysferlin function following our identification of new members of the dysferlin complex and by describing a beneficial effect of bone marrow transplantation in a mouse model for dysferlinopathy