Estratégias para a conservação ex situ de Dendrocalamus asper e micropropagação de espécies do gênero Guadua (Bambusoideae, Poaceae)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2018.Neste trabalho foram estudadas três espécies de bambus lenhosos sendo uma espécie nativa da Ásia (Dendrocalamus asper), uma nativa das Américas (Guadua angustifolia) e a última endêmica da região Centro-oeste (Guadua magna), com o objetivo de elucidar questões sobre a germinação, conservação ex situ e micropropagação. Dessa forma, referente as sementes e a germinação de D. asper, foram realizados estudos de germinação em papel germitest, substrato Bioplant e meio de cultivo de MS em duas condições de luminosidade: claro e escuro. Também foram realizados testes para desinfestação de sementes com NaOCl2 e HgCl2. Além da avaliação da germinação em tubos de ensaio com de MS semissólido e em biorreatores RITA com meio de MS liquido com adição (Sac+) ou não (Sac-) ao meio. Como resultado o meio de cultivo in vitro aliado a desinfestação com cloreto de mercúrio foi o mais promissor para germinação de D. asper independente das condições de luminosidade. Após a germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas com três fenótipos distintos (verde, variegado e albino), quantificou-se o DNA nuclear através de citometria de fluxo e os fenótipos não apresentaram diferenças na quantidade de DNA. Durante a germinação e desenvolvimento pós-seminal, também realizou-se a caracterização anatômica, histoquímica e análise bioquímicas, constatando-se que as sementes desta espécie possuem endosperma amiláceo, camada de aleurona e embrião maduro bem desenvolvido. Sendo o amido o metabólito mais abundante, seguido por proteínas e lipídeos. Para o protocolo de criopreservação, sementes de D. asper foram dessecadas por 0, 24, 48, 96 e 144 horas em dessecador. Ao término de cada período de dessecação as sementes foram divididas em três partes: uma parte foi seca em estufa por 24 horas para medir o teor de umidade; a segunda parte foi colocada para germinar em meio de MS e a terceira parte foi imersa em nitrogênio líquido (-196 ºC) por 48 horas, depois desse período foram descongeladas e inoculadas em meio de MS. A dessecação de sementes por até 144 horas garantiu um teor de umidade de cerca de 5% e não influenciou na germinabilidade tanto em nenhum dos tratamentos (-NL e +NL), o que indica o possível comportamento ortodoxo destas sementes. A conservação ex vitro foi realizada a partir do armazenamento de sementes sob as temperaturas de 25 (controle), 6, -20 e -196 ºC por 0, 30, 90, 180, 360 e 600 dias. Após cada período de armazenamento as sementes foram inoculadas em tubos com meio de MS. As plantas obtidas da germinação foram aclimatizadas. Nos períodos de armazenamento de 0, 360 e 600 dias foram coletadas sementes para realização de análises bioquímicas, onde quantificou-se amido, proteínas e lipídeos. Sementes de D. asper mantem sua viabilidade por até 600 dias quando conservadas nas temperaturas de -20 ºC e -196 ºC, enquanto na temperatura de 25 ºC ocorre decréscimo acentuado da viabilidade aos 600 dias, além de ocorrer o desenvolvimento anormal de plantas. A análise da composição bioquímica das sementes conservadas corroborou com os resultados obtidos no experimento de germinação, apresentando poucas diferenças para os metabólitos entre os períodos de armazenamento. Para as espécies G. magna e G. angustifolia objetivou-se desenvolver um protocolo de micropropagação completo, a partir de mudas mantidas em casa de vegetação onde foram tratadas ou não com fungicida Mythos. Em laboratório, para etapa de estabelecimento segmentos nodais foram inoculados em meio de MS com diferentes formulações: MS normal; MS com 3,0 m.L-1 de PPM e MS com 1 m.L.L-1 de fungicida Carbendazin. A adição de Carbendazin e PPM ao meio, reduziram a contaminação em G. magna e não influenciaram a taxa de contaminação e brotação em G. agustifolia. Em seguida, as brotações obtidas da etapa de estabelecimento que estavam livres de contaminação, foram multiplicadas em meio de MS com 3,0 mg.L-1 de BAP em duas consistências: líquida e semissólida por cinco subcultivos e ao final desse período realizou-se a verificação da fidelidade genética dos clones através de marcadores ISSR. De maneira geral, o meio líquido se mostrou mais eficiente em comparação ao meio semissólido para as duas espécies estudas e o uso de marcadores ISSR, permitiu verificar a similaridade de 87% entre as duas espécies e ausência de polimorfismo entre os clones obtidos durante a multiplicação em ML e MSS. O enraizamento foi realizado em meio MS1/2 acrescido de 3,0 mg.L-1 de AIB também nas consistências: liquida e semissólida. Em seguida as plantas foram aclimatizadas em substrato Bioplant e câmara de crescimento BOD. No enraizamento, a adição de 3,0 mg.L-1 de AIB no meio líquido ou semissólido possibilitou um enraizamento de 45% no ML e 30% no MSS para G. magna e 53% ML e 62% MSS para G. angustifolia. Para o desenvolvimento de um protocolo completo de micropropagação para G. magna, foram utilizadas sementes coletadas em áreas naturais, que foram desinfestadas com hipoclorito de sódio (NaOCl2), cloreto de mercúrio (HgCl2) e/ou fungicida sistêmico Carbendazin isolados ou em combinação e adicionados ao meio de cultivo. O hipoclorito de sódio, cloreto de mercúrio e fungicida sistêmico Carbendazin podem ser utilizados para desinfestação de sementes e no meio de cultivo sem interferir na germinação. Para a multiplicação foram avaliadas as citocininas CKs: 6-benzilaminopurina (BAP), cinetina (Kn) e metatopolina (mT) nas concentrações 0,0; 6,66, 13,32, 19,98 e 26,64 μM em meio de MS líquido. Ao final desta etapa realizou-se a quantificação de clorofila e a análise de fidelidade genética com auxílio de marcadores ISSR para os melhores tratamentos. Também foram avaliados os sistemas de cultivo MSS, MLE e MLA com 6,66 μM de mT e explantes de diferentes posições do broto (1º nó, 2º nó, 3º nó, base do broto e broto inicial). Durante a multiplicação a citocinina mT na concentração de 6,66 μM, explantes da base, do broto e o meio líquido possibilitam as melhores taxas de multiplicação. Brotações oriundas de meio de multiplicação com Kn apresentaram menores teores de clorofila. A realização de cinco subcultivos, não induziu a ocorrência e variações somaclonais nas brotações de G. magna. O enraizamento de microestacas foi realizado em meio de MS semissólido com as auxinas ácido indolacético (AIA), ácido naftalenoacético (ANA) e ácido indolbutírico (AIB) nas concentrações 0,0; 1,23; 2,45; 4,90; 9,80 e 14,70 μM. Também foram avaliadas as concentrações do meio de MS (MS1/4, MS1/2, MS3/4 e MS) e explantes de diferentes posições do broto (1º nó, 2º nó, 3º nó, base do broto e broto inicial). Ao final da etapa de enraizamento as plantas foram aclimatizadas e avaliou-se a sobrevivência. Para o enraizamento a auxina AIB na concentração 4,90 μM induziu a melhor taxa de enraizamento. Enquanto a utilização de brotos iniciais como explante em meio de MS em qualquer concentração (MS1/4, MS1/2, MS3/4 e MS) também induziram boas taxas de enraizamento. Para todos os experimentos de aclimatização plantas inteiras com raízes e parte aérea bem desenvolvidos apresentam até 100% de sobrevivência.In this work three woody bamboos species were studied: a native species of Asia (Dendrocalamus asper), a native of the Americas (Guadua angustifolia) and the last is endemic of the Central-western region (Guadua magna), with the objective of elucidating questions about the germination, ex situ conservation and micropropagation. So, the germination studies were carried out on germitest paper, Bioplant substrate and MS medium in two light conditions (light and dark). The tests were also carried out for seed disinfestation with NaOCl2 and HgCl2. Moreover the evaluation of germination in test tubes with semi-solid MS and in RITA bioreactors with liquid MS medium with addition (Sac) or not (Sac-) in the medium. As a result, the in vitro culture medium combined with disinfestation with mercury chloride was the most promising for germination of D. asper, regardless of the light conditions. After the seed germination and the development of plants with three distinct phenotypes (green, variegated and albino), the nuclear DNA was quantified by flow cytometry. The phenotypes showed no differences in the amount of DNA. During the germination and post-seminal development, the anatomical characterization, histochemistry and biochemical analysis were also carried out. It was verified that the seeds of this species have amylaceous endosperm, aleurone layer and well developed mature embryo. Where the starch is the most abundant metabolite, followed by proteins and lipids. For the cryopreservation protocol, D. asper seeds were desiccated for 0, 24, 48, 96 and 144 hours in desiccator. At the end of each desiccation period the seeds were divided into three parts: one part was oven-dried for 24 hours to measure the moisture content; the second part was placed to germinate in MS medium and the third part was immersed in liquid nitrogen (-196 °C) for 48 hours, after that period they were thawed and inoculated in MS medium. The desiccation of seeds for up to 144 hours guaranteed a moisture content of about 5% and did not influence the germinability in either of the treatments (-NL and +NL), indicating the possible orthodox behavior of these seeds. Ex vitro conservation was performed from the storage of seeds under the temperatures of 25 (control), 6, -20 and -196 ° C for 0, 30, 90, 180, 360 and 600 days. After each storage period the seeds were inoculated in tubes with MS medium. The plants obtained from the germination were acclimatized. In the storage periods of 0, 360 and 600 days seeds were collected for biochemical analysis, where starch, proteins and lipids were quantified. Seeds of D. asper maintain their viability for up to 600 days when stored at temperatures of -20 ° C and -196 ° C, while at 25 ° C there is a marked decrease in viability at 600 days, moreover it is observed an abnormal development of plants. The biochemical composition analysis of the conserved seeds corroborated with the results obtained in the germination experiments, presenting few differences for metabolites among the storage periods. For the species G. magna and G. angustifolia it was aimed to develop a complete micropropagation protocol, from seedlings kept in a greenhouse where they were treated with a fungicide (Mythos) or not. In the laboratory, nodal segments were inoculated in MS medium with different formulations: normal MS; MS with 3.0 m.L-1 of PPM and MS with 1 m.L.L-1 of Carbendazin fungicide. The addition of Carbendazin and PPM in the medium reduced the contamination in G. magna and did not influence the rate of contamination and sprouting in G. agustifolia. Then, the free of contamination sprouts, obtained from the establishment stage, were multiplied in MS medium with 3.0 mg.L-1 BAP in two consistencies: liquid and semi-solid by five subcultures and at the end of this period, the genetic fidelity of the clones was verified through ISSR markers. In general, the liquid medium was more efficient in comparison to the semi-solid medium for the two species studied and the use of ISSR markers allowed to verify the similarity of 87% between the two species and absence of polymorphism among the clones obtained during multiplication in LM and SSM. The rooting was carried out in MS1/2 medium plus 3.0 mg.L-1 of IBA also in the consistencies: liquid and semisolid. Then the plants were acclimatized on Bioplant substrate and B.O.D. growth chamber. In rooting, the addition of 3.0 mg.L-1 IBA in the liquid or semi-solid medium allowed a 45% rooting in the LM and 30% in the SSM for G. magna and 53% LM and 62% SSM for G. angustifolia. For the development of a complete micropropagation protocol for G. magna, seeds collected in natural areas were used that were disinfested with sodium hypochlorite (NaOCl2), mercury chloride (HgCl2) and/or systemic fungicide Carbendazin alone or in combination and added to the culture medium. Sodium hypochlorite, mercury chloride and systemic fungicide Carbendazin can be used for seed disinfestation and in the culture medium without interfering with germination. For the multiplication, the cytokinins (CKs) were evaluated: 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (Kn) and meta-topolin (mT) in concentrations 0.0; 6.66, 13.32, 19.98 and 26.64 μM in liquid MS medium. At the end of this step, chlorophyll quantification and genetic fidelity analysis were performed using ISSR markers for the best treatments. The semisolid medium (SSM), liquid medium stationary (LMST) and liquid medium shaking (LMSH) culture systems with 6.66 μM mT and explants from different shoot positions (1st node, 2nd node, 3rd node, bud base and initial bud) were also evaluated. During the multiplication, cytokinin mT at 6.66 μM concentration, explants from the base, bud and the liquid medium provide better multiplication rates. Sprouting from medium of multiplication with Kn had lower levels of chlorophyll. The realization of five subcultures, did not induce the occurrence and somaclonal variations in the shoots of G. magna. The micro-stem rooting was performed in semisolid MS medium with the auxins indolacetic acid (IAA), naphthaleneacetic acid (NAA) and indolbutiric acid (IBA) in concentrations 0.0, 1.23, 2.45, 4.90, 9.80 and 14.70 μM). The concentrations of MS medium (MS1/4, MS1/2, MS3/4 and MS) and explants from different shoot positions (1st node, 2nd node, 3rd node, bud base and initial bud) were also evaluated. At the end of the rooting stage the plants were acclimatized and their survival was evaluated. For rooting of the auxin IBA at the concentration of 4.90 μM induced the best rooting rate. While the use of initial buds as an explant in MS medium at any concentration (MS1/4, MS1/2, MS3/4 and MS) also induced good rooting rates. For all acclimatization experiments, whole plants with well developed roots and shoots have up to 100% of survival