Isolamento e caratterizzazione biologico-molecolare di cellule staminali tumorali da linee cellulari derivanti da melanoma primario

Il melanoma è un tumore cutaneo maligno caratterizzato da un’elevatissima propensione alla metastasi, ovvero alla diffusione delle cellule maligne ai vari distretti corporei, e da una notevole resistenza chemioterapica. Un numero sempre crescente di prove indica che molti tumori solidi umani contengono una sottopopolazione di cellule staminali tumorali, le Cancer Stem Cells (CSCs), in grado di sostenere la crescita del tumore a causa della loro capacità di autorinnovarsi e di generare i diversi tipi cellulari che compongono il tumore stesso. Cellule con caratteristiche staminali, le Melanoma Stem Cells (MSCs), sono state recentemente identificate anche nel melanoma. Sebbene ci siano ancora incertezze sulla loro frequenza nella massa tumorale e sui marker che meglio le definiscono, è noto che le MSCs sono dotate di una tumorigenicità più elevata, quando impiantate in topi da laboratorio, rispetto alle Melanoma non-Stem Cells (MnSCs); sono anche dotate di una maggiore capacità di autorinnovamento e di una maggiore chemioresistenza. A causa di queste caratteristiche biologiche, si pensa che la mancata eradicazione delle MSCs sia una delle ragioni del fallimento delle attuali terapie. Indagare sul profilo molecolare delle MSCs, in modo da identificare i marker coding e non-coding che le caratterizzano, è quindi considerato di cruciale importanza per poter sviluppare approcci terapeutici più efficaci. Scopo di questo lavoro di tesi è l’isolamento, tramite sorting per marker già noti, e la caratterizzazione biologico-molecolare delle MSCs e delle MnSCs ottenute da linee cellulari di melanoma primario. Come primo passo ho caratterizzato, tramite Real Time PCR, dieci linee cellulari di melanoma primario (WM35, WM278, WM793B, WM902B, WM983A, WM1552C, WM1575, WM3211, WM1361A e WM1366) per quanto riguarda l’espressione dei marker di MSCs riportati ad oggi in letteratura: ABCB1, ABCB5, ABCG2, CD133, CD166, CD271, CXCR6, ALDH e NESTINA. Relativamente ai marker CD271 e ALDH ho anche eseguito saggi citofluorimetrici per calcolare la percentuale di cellule positive per essi, ottenendo dati concordanti con quelli ottenuti tramite Real Time PCR. L’integrazione dei dati di Real Time PCR e di citofluorimetria mi ha permesso di restringere il pool delle dieci linee cellulari alle sole quattro che esprimono sia il marker CD271 che il marker ALDH, ossia le linee WM278, WM793B, WM983A e WM1361A. Nella seconda parte del lavoro, per scegliere se dare priorità al CD271 o all’ALDH per il sorting, ho utilizzato il vemurafenib, farmaco di ultima generazione utilizzato nella lotta contro il melanoma, noto per la capacità di inibire selettivamente la chinasi BRAF quando mutata sul residuo V600 e di indurre un aumento dei livelli di espressione dei marker di MSCs. Dopo essermi accertata, tramite analisi del ciclo cellulare e curva di crescita, che soltanto le linee WM278, WM793B e WM983A sono sensibili al vemurafenib, in quanto recanti la mutazione BRAFV600E, sono andata a valutare, tramite Real Time PCR, se il trattamento con il farmaco induce una variazione dei livelli di espressione dei marker di MSCs. Ciò che ho ottenuto nelle linee sensibili è stato un aumento dei livelli di CD271, ma non di ALDH. Ho anche confermato tale aumento a livello proteico tramite saggio citofluorimetrico. Nella terza parte del lavoro ho quindi sottoposto a sorting le linee cellulari WM278, WM793B e WM983A utilizzando CD271 come “marker di separazione”. Sulle due popolazioni cellulari ottenute, CD271+ e CD271-, ho poi eseguito saggi molecolari e cellulari allo scopo di evidenziare se le cellule CD271+ hanno proprietà staminali più pronunciate rispetto alle cellule CD271-. Ho articolato la caratterizzazione molecolare, tramite Real Time PCR, in tre fasi: analisi dei livelli di espressione dei marker di MSCs, analisi dei livelli di espressione dei marker delle embryonic stem cells (cMYC, KLF4, NANOG, OCT4, SOX2) e analisi dei livelli di espressione dei marker del melanocytic lineage (DCT, MITF e SOX10). Da questa prima analisi è emerso che le cellule CD271+ hanno aumentati livelli di molti dei suddetti marker e quindi caratteristiche di dedifferenziamento più accentuate rispetto alle cellule CD271-, in accordo con la definizione di MSCs. La caratterizzazione delle sorted populations si è conclusa con saggi cellulari (curva di crescita, clonogenicity assay, soft agar assay e limiting dilution assay) volti a dimostrare la proprietà distintiva delle cellule staminali tumorali: la self-renewal, ossia la capacità di autorinnovamento. In effetti, tali saggi sono stati in grado di mettere in evidenza come, in condizioni di crescita “stringenti”, le cellule CD271+ siano in grado di autorinnovarsi di più rispetto alle cellule CD271-. Il mio lavoro di tesi proseguirà con l’analisi del miRNoma delle MSCs e delle MnSCs che ho identificato e caratterizzato. Assieme a quanto già noto sui marker proteici, ci aspettiamo infatti che l’analisi del non-coding transcriptome possa contribuire a far nuova luce su una problematica così complessa e delicata come la staminalità del melanoma