Il derivato spiro-ossoindolico ISA27 ostacola l?interazione tra p53 e il suo inibitore naturale MDM2 e riattiva la funzione oncosoppressore di p53 in cellule di glioblastoma multiforme umano

Il Glioblastoma multiforme (GBM) è uno dei tumori più comuni e aggressivi del Sistema Nervoso Centrale. Nonostante i progressi tecnici in Neurochirurgia e Clinica Neuro-oncologica, la prognosi per i pazienti con GBM è ancora molto scarsa. Infatti, la maggior parte dei pazienti sono generalmente insensibili agli attuali interventi genotossici e muore entro un anno dalla diagnosi. Uno dei principali fattori che rendono il GBM resistente alla terapia attualmente in uso è rappresentato dall’inattivazione di p53. La proteina p53 è un potente fattore di trascrizione che, in condizioni normali, si attiva in risposta a danno genotossico, con conseguente induzione dell’arresto del ciclo cellulare e riparazione del danno al DNA. Se invece il danno del genoma risulta essere troppo esteso, p53 stimola la produzione di proteine che inducono apoptosi e/o senescenza cellulare. In una piccola percentuale di casi di GBM, p53 presenta sostituzioni amminoacidiche, causate da mutazioni nucleotidiche nel suo gene, che determinano la perdita della sua attività. Nella maggior parte dei casi, invece, questo tumore esprime p53 con una sequenza amminoacidica normale ma la sua funzione è comunque inibita a causa di un aumento dell’espressione del suo principale inibitore intracellulare, l’oncoproteina MDM2 (Murine Double Minute 2). MDM2 è capace di regolare l’attività di p53, legandosi al dominio di p53 coinvolto nel legame al DNA, e ne blocca la attività di trans-attivazione genica. Inoltre, grazie alla sua attività di ubiquitina ligasi, MDM2 consente l’esportazione di p53 dal nucleo al citoplasma e ne media la degradazione via proteosoma. L’uso di inibitori di MDM2, che interferiscono con il legame di MDM2 a p53 e, conseguentemente, possono riattivare la funzione oncosoppressiva di p53, potrebbe essere un valido approccio per inibire la crescita delle cellule tumorali. Soprattutto nel caso del GBM in cui la funzione di p53 è repressa dalla eccessiva espressione di MDM2. Lo scopo della presente tesi è stato quello di valutare la potenziale attività antitumorale e caratterizzare il meccanismo di azione cellulare della nuova molecola sintetica appartenente alla classe delle spiro(ossoindolo-3,3’-tiazolidine), ISA27. Tale derivato precedentemente era risultato capace di inibire la formazione del complesso MDM2-p53 ricostruito in vitro mediante l’impiego di proteine ricombinanti. Come modello cellulare di glioblastoma umano sono state impiegate le cellule U87MG e U343MG che presentano p53 con sequenza amminoacidica normale e sovraesprimono MDM2. Al fine di avere un riferimento dell’efficacia di ISA27 sono stati condotti esperimenti trattando le cellule di GBM con ISA27 e in parallelo con il noto inibitore di MDM2, Nutlina-3. I risultati hanno dimostrato che ISA27 inibisce la proliferazione/sopravvivenza delle cellule di GBM in maniera dose dipendente a seguito del trattamento di 1 giorno. La dose di ISA27 capace di inibire il 50% della proliferazione/sopravvivenza (IC50) delle cellule U87MG e U343MG è risultata rispettivamente 2.5 µM e 5 µM. ISA27, testato alla rispettiva concentrazione di IC50 in ciascuna linea cellulare, ha evidenziato la capacità di mantenere una stabilità temporale della proteina p53. In particolare, è stato osservato che nella fase iniziale del trattamento la stabilità di p53 non è dovuta a sintesi de-novo di mRNA codificante p53 e di proteina p53 ma a una ridotta interazione tra p53 e MDM2. A seguito del trattamento a lungo termine (fino a 5 giorni) delle cellule di GBM con ISA27 è stata osservata una drastica riduzione di cellule vive. La rimozione di ISA27 non ha comportato un recupero della normale crescita delle cellule rimaste, suggerendo la compromissione dei meccanismi che regolano la progressione del ciclo cellulare