Study of the influence of a DC electric field on the development of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A bioelectricidade pode influenciar a polarização de uma célula, responsável pela divisão assimétrica, pelo que tem um impacto significativo no desenvolvimento de tecidos ao contribuir para controlar a migração e orientação de células e também a proliferação, diferenciação e apoptose celulares. Estas propriedades da bioelectricidade em tecidos biológicos tornam-na numa ferramenta importante em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois permite controlar várias respostas fisiológicas a estímulos eléctricos e usá-las para fins benéficos. O nematóide Caenorhabditis elegans é um organismo primitivo, mas cuja fisiologia partilha várias características da biologia humana. Estas características, juntamente com a sua simplicidade de cultivar em grandes populações e de ser conveniente para análise e manipulação genética, tornam-no num dos organismosmodelo mais vastamente utilizados em investigação científica, existindo actualmente uma enorme quantidade de informação disponível sobre este nematóide. O embrião do C. elegans representa um modelo ideal para o estudo da divisão celular e da embriogénese, visto que o seu desenvolvimento é altamente reprodutível e facilmente observável. Além disso, o padrão de desenvolvimento do embrião é praticamente invariável, tornando possível construir um diagrama que representa toda a sua linhagem celular, o que facilita imensamente a análise da embriogénese. A motivação deste projecto surge do conhecimento de que vários seres vivos, como a hidra ou a salamandra, possuem uma grande capacidade de regeneração que está grandemente relacionada com a bioelectricidade. Compreender e controlar os seus mecanismos será certamente um grande avanço na área de engenharia de tecidos e terá como consequência o surgimento de diversas potenciais aplicações. Este projecto tem como objectivo aplicar a aplicação de um campo eléctrico DC num organismo vivo, de forma a induzir uma resposta por parte dele. Devido às suas características, o embrião do nematóide C. elegans foi escolhido como organismo modelo para a aplicação deste estímulo eléctrico. A principal assumpção é que o campo eléctrico aplicado ao longo do eixo antero-posterior do embrião do nematóide C. elegans, induza uma acumulação de carga oposta nas suas extremidades anterior e posterior com o intuito de alterar o potencial de membrana, onde se levantou a hipótese de poderem induzir respostas celulares diferentes em cada extremidade, causando alterações na embriogénese. A ideia surge de uma analogia à aplicação de um gradiente de temperatura ao longo desse mesmo eixo, sabendo-se actualmente que induz uma resposta relativamente à duração de ciclos celulares, visto que é fortemente dependente da temperatura. Através dos resultados, pretende-se também avaliar a utilidade deste embrião como um organismo-modelo para o estudo do impacto de campos eléctricos DC em tecido vivo, visto que outros embriões, como de anfíbios ou pintos, apresentam grandes distúrbios no seu desenvolvimento quando estimulados com campos eléctricos contínuos, com consequências catastróficas no organismo final. A tecnologia dos micro-sistemas permite controlar eficazmente o ambiente celular de uma forma bastante precisa. Assim, um sistema microfluídico é usado como plataforma para estudar o impacto da aplicação do campo eléctrico ao embrião. Este é colocado no interior de um microcanal contendo PBS (tampão fosfato-salino), um bom electrólito e ao mesmo tempo biocompatível para o seu desenvolvimento. Recorrendo a eléctrodos de platina, é aplicada uma diferença de potencial nas extremidades do canal, o que torna possível a existência de uma corrente eléctrica que deverá resultar numa acumulação de carga oposta nas extremidades do embrião, visto que a sua resistividade deverá ser superior à do PBS. A largura e altura do canal são semelhantes à espessura do embrião, o que garante que o campo eléctrico passa através do embrião ou que seja desviado por ele, no caso de este ser isolante. Tendo em conta que o campo eléctrico propaga-se através do canal em direcção ao embrião, é necessário saber qual a sua magnitude à volta dele. Além disso, interacções físicas como o efeito de Joule e reacções redox entre os eléctrodos e o electrólito podem alterar a temperatura e o pH no interior do canal e comprometer o desenvolvimento do embrião de forma indesejada. Assim é também efectuada uma caracterização física detalhada do sistema microfluídico, com o intuíto de saber quais os principais fenómenos físicos que podem ocorrer no interior do canal durante a aplicação do campo eléctrico. Esta caracterização permite tomar as medidas necessárias para minimizar estes efeitos secundários que possam perturbar o normal desenvolvimento do embrião. A caracterização física do sistema consiste essencialmente numa análise das interacções dos eléctrodos de platina com uma solução de cloreto de sódio, o principal constituinte do PBS e em determinar a relação entre a corrente eléctrica no canal e a diferença de potencial aplicada. Para isso são efectuadas medições experimentais e simulações recorrendo ao software de elementos finitos COMSOL Multiphysics. O procedimento experimental para a análise do impacto do campo eléctrico no embrião começa com a recolha de um embrião de um nematóide hermafrodita adulto, proveniente de uma cultura em pratos de agarose semeados com Escherichia coli como fonte de alimento. O embrião escolhido deve estar no início do desenvolvimento, de preferência após a meiose, de forma a poder ser estimulado o mais cedo possível. Sabese que perturbar os eventos iniciais da embriogénese pode ter consequências em todo o restante desenvolvimento, visto que este depende grandemente das primeiras divisões celulares. Recolhido o embrião, este é inserido no microcanal, onde é fixado e permanece durante todo o ensaio experimental. De seguida, o campo eléctrico é aplicado através da aplicação de uma diferença de potencial nos eléctrodos em contacto com as extremidades do canal. Pontes salinas de agarose são utilizadas em algumas experiencias para evitar a contaminação do electrólito com produtos das reacções químicas que ocorrem na superfície dos eléctrodos. O desenvolvimento do embrião é observado através de microscópios invertidos equipados com contraste de fase. Imagens de time-lapse são capturadas e posteriormente analisadas recorrendo ao software ImageJ. Eventos da embriogénese seleccionados para análise são comparados para embriões em experiencias de controlo e embriões estimulados com o campo eléctrico. Métodos de análise estatística são efectuados para auxiliar a comparação. Parâmetros a observar e comparar são os tempos de ocorrência dos eventos seleccionados e orientação e posição de células no embrião. O comportamento da minhoca juvenil após o nascimento também pode fornecer informação relativamente à embriogénese, pelo que também é analisado. A caracterização do chip revelou que uma tensão de 5V é apropriada para criar um campo eléctrico com dimensões fisiológicas (cerca de 0.3mV/μm), não aumentando a temperatura para valores fora dos limites de desenvolvimento normal do embrião. Alterações do pH foram minimizadas através da utilização das pontes salinas inseridas nas entradas do canal. A comparação entre embriões de controlo e embriões estimulados revela que não existem grandes diferenças entre os eventos da embriogénese de embriões de controlo e embriões estimulados pelo campo eléctrico, o que sugere que o embrião resiste ao campo eléctrico, talvez devido à barreira de permeabilidade presente na sua carapaça. Pequenas diferenças nos tempos embriológicos entre embriões de controlo e estimulados sugerem que o campo eléctrico possa ter efeitos a longo prazo na embriogénese, retardando os seus eventos mais tardios. As diferenças são demasiado pequenas para se poder tirar alguma conclusão, contudo, os resultados sugerem que deveria ser feita uma análise mais detalhada ao ciclo celular de certas células do início da embriogénese, o que não foi possível com o equipamento disponível. Comparando estes resultados com os de outros estudos com embriões, como por exemplo em anfíbios ou pintos, conclui-se que o impacto do um campo eléctrico DC no desenvolvimento do embrião do nematóide C. elegans não é tão significativo como nesses modelos, o que os torna preferíveis para estudos com embriões intactos. No entanto, existe ainda a possibilidade de estudos a nível de células isoladas extraídas do embrião e também não é de descartar a hipótese de aplicar um campo eléctrico AC ou de tentar remover a carapaça do embrião em futuras investigações.Bioelectricity has an impact on the development of tissues because it can influence cell polarization, essential for asymmetric cell division. This feature may be an important tool for tissue engineering and regenerative medicine applications. The nematode Caenorhabditis elegans is a primitive organism, but whose physiology shares several characteristics of human biology. Its embryo is an ideal model for the study of cell division and embryogenesis, since its development is almost invariant and highly reproducible and readily observable. This project has the objective of studying the impact of a DC electric field in the C. elegans embryo development and to assert if this organism is a good model for further research in this field. To accomplish it, a DC electric field is applied in a microchannel filled with PBS, where to the embryo is confined. Embryogenesis is studied by analysing selected development stages, which are compared for control and electric field experiments. To optimize the application of the electric field to the embryo and minimize other physical phenomena which can disturb embryogenesis, a detailed physical characterization of the microfluidic system is also performed. The results show that there are no big differences in the events of embryogenesis, suggesting that the embryo resists to the electrode field, perhaps due its eggshell. Nevertheless, small differences in embryological times suggest that the electric field can have long term effects on embryogenesis, and that a more detailed analysis should be performed. In summary, the embryo nematode C. elegans is not as suited to study the impact of DC electric fields in embryogenesis as other embryo models, such as amphibians. However, there is still the possibility of studies of single isolated embryo cells. Besides, it is not discarded the possibility of applying an AC electric field or attempting to remove the eggshell in future studies