Prevalence and phylogeny of Plasmodium ovale and P. malariae in Bangladesh

Malaria-Infektionen sind auch heutzutage noch eine der größten Bürden für das Gesund-heitssystem weltweit. Kürzlich nachgewiesene Artemisinin-Resistenzen in Südostasien erschweren Bemühungen der Malaria Herr zu werden. Daher sind hohe Standards in der Diagnose der Malariaerreger aus der Gattung Plasmodium notwendig um Malaria zu kon-trollieren und adäquat zu therapieren. Obwohl die Nachteile der Malariadiagnose mittels Mikroskopie bekannt sind, ist jene immer noch der Goldstandard, das wiederum zu einer Unterschätzung der wahren Malariazahlen führen kann und speziell den Nachweis weniger häufiger und dokumentierter Arten wie P. ovale, P. malariae und P. knowlesi in Asien betrifft. Die Phylogenie von P. ovale wird derzeit neu bearbeitet und eine kürzlich veröf-fentlichte Studie teilte die ursprüngliche Art P. ovale in zwei sympatrisch vorkommende Arten auf: P. ovale curtisi und P. ovale wallikeri. Ein Hauptziel dieser Studie war die Untersuchung des Vorkommens sowie der Prävalenz von P. ovale (P. o. curtisi und P.o. wallikeri), sowie von P. malariae und P. knowlesi in den Chittagong Hill Tracts in Bangladesh. Dafür wurden 2.246 Blutproben auf Filterpapier von asymptomatischen, sowie febrilen Studienteilnehmern mittels einer nested PCR die an höchst konservierten Regionen der kleinen ribosomalen Untereinheit des SSU rRNA Gens bindet, untersucht. 1,02% aller Studienteilnehmer waren P. ovale positiv. Bei 0,45% konn-te eine Infektion mit P. o. curtisi, bei 0,53% mit P. o. wallikeri, sowie bei 0,05% eine Mischinfektion mit beiden Arten diagnostiziert werden. Der Nachweis von sympatrischen Vorkommen beider Erreger konnte im Distrikt Bandarban erbracht werden, wobei die be-troffenen Patienten keine oder milde Symptome aufwiesen. Außerdem konnte ein geneti-scher Dimorphismus jener zwei Arten anhand verschiedener PCR-Techniken (z.B. Ver-gleich verschiedener Protokolle mit SSU rRNA Gen als Zielsequenz; PoTRA) sowie von Sequenzanalysen (SSU rRNA, Cox1, PoRBP2) bestätigt werden. Im Rahmen dieser Studie konnte nicht nur P. ovale erstmals in Bangladesh beschrieben werden, sondern auch die erstmalige Beschreibung von sympatrischen Vorkommen von P. o. wallikeri und P. o. cur-tisi in (Süd) Asien erbracht werden. Eine hohe P. malariae-prävalenz von 9,6% konnte bei asymptomatischen Patienten mit PCR-bestätigter Malaria nachgewiesen werden. Hingegen wurden Infektionen mit diesem Erreger nur in 3,7% aller Malaria-positivien Fieberpatienten gefunden. In keiner dieser Studien konnte P. knowlesi nachgewiesen werden. Mittels einer neuen direkten nested PCR Technik wurde die Diagnose von Plasmodium sp. von auf Filterpapier gesammelten Blutproben ohne die zeitaufwendige Anwendung diver-ser DNA-Isolierungstechniken etabliert und mit standardisierten nested PCR Protokollen verglichen. Hierbei wies die direkte PCR sowohl eine höhere Sensitivität als auch ein ge-ringeres Parasitennachweisbarkeitsgrenze von 3 Parasiten/µl auf. Versuche P. vivax unter Feldbedingungen für 72 Stunden zu kultivieren schlugen fehl. Es konnte zwar bei einigen Medien eine erfolgreiche Reinvasion nachgewiesen werden, je-doch wurde bei keinem der über 90 verschiedenen untersuchten Kultivierungstechniken ein mit P. falciparum vergleichbares exponentielles Wachstum beobachtet werden, da es nach einer Kultivierungszeit von 48 Studien zu einem Abfall der Parasitämie kam.Malaria infections are still one of the major global health burdens, and recent reports of emerging artemisinin resistance in Southeast Asia will add another challenge to malaria control efforts. High standards in the diagnosis of the malaria-causing Plasmodium species are essential in order to control and adequately treat malaria. In spite of its known limita-tions, microscopy remains the gold standard of malaria diagnosis which may lead to a sig-nificant underestimation of the true malaria burden, especially of less prevalent and less documented species such as P. ovale, P. malariae and P. knowlesi in Asia. Also the phy-logeny of P. ovale is pending and recent studies established that P. ovale comprises 2 sym-patric occurring non-recombining species; P. ovale curtisi and P. ovale wallikeri. This project aimed to detect the distribution and prevalence of P. ovale (P. o. curtisi and P. o. wallikeri), P. malariae and P. knowlesi in the Chittagong Hill Tracts in Bangladesh. Therefore 2,246 blood spots of asymptomatic and febrile participants were analyzed by nested PCR targeting highly conserved regions of the small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene. P. ovale was detected in 1.02% of the study participants; 0.45% thereof were infected with P. o. curtisi, 0.53% with P. o. wallikeri and 0.04% presented infections with both parasites. Both parasite species occur sympatric in the District of Bandarban and demonstrate none or mild symptoms. Furthermore dimorphism between both species was confirmed by different PCR techniques (e.g. comparison of different protocols targeting the SSU rRNA gene; PoTRA gene) and multilocus sequence analysis (SSU rRNA, Cox 1, PoRBP2). Not only the first description of P. ovale in Bangladesh was documented in the course of this thesis, but also the sympatric distribution of P. o. curtisi and P. o. wallikeri was confirmed in (South) Asia for the first time. A high prevalence of 9.6% of P. malariae was found in those asymptomatic patients posi-tive for Plasmodium sp. by nested PCR. In comparison, 3.7% of those fever patients pre-senting malaria were diagnosed as P. malariae infections. There was no evidence of P. knowlesi within those studies. Furthermore we demonstrated that the newly employed use of direct nested PCR enabled the detection of Plasmodium sp. from blood spots on filter papers without the time-consuming use of DNA isolation and compared it to a standardized nested PCR technique. Direct nested PCR is highly sensitive and the limit of detection is as low as 3 malaria para-sites/µl. However, attempts to cultivate P. vivax under field conditions for 72 hours failed. Al-though reinvasion was achieved with some media, none of the more than 90 cultivation techniques resulted in an exponential growth rate comparable to the growth of P. falcipa-rum because of a decline of parasitemia after 48h