Analysis of senescence markers and impact of drug-induced senescent neuroblastoma cells on tumour cell proliferation and immunomodulation

Zellulare Seneszenz ist ein Zustand, der durch irreversiblen Proliferationsarrest charakterisiert ist, durch unterschiedliche Arten von intrinsischem und extrinsischem Stress ausgelost werden kann und des Weiteren mit Tumorsuppression assoziiert ist. Seneszente Zellen bleiben metabolisch aktiv und sezernieren viele Faktoren. Dazu gehoren Wachstumsfaktoren und Zytokine, welche die umgebenden Zellen beeinflussen und deren Zellwachstum fordern konnen. Das Neuroblastom (NB) ist ein Tumor des vegetativen Nervensystems und der haufigste extrakraniale solide Tumor im Kindesalter. Die Amplifikation des MYCN Onkogens ist charakteristisch fur aggressive Formen des Neuroblastoms und ein hoch-signifikanter Marker fur eine schlechte Prognose. Kurzlich wurde gezeigt, dass in MYCN amplifizierten NB-Zellen, die aus Primartumoren von Stadium 3 oder 4 Patienten stammen, durch 6-8 wochige Behandlung mit Hydroxyurea in vitro Seneszenz induziert werden kann. Nach Behandlung mit Hydroxyurea reduzieren seneszente NB-Zellen ihre MYCN Kopien Zahl und den NBTumormarker GD2, wahrend die Oberflachenmolekule CD44 und MHC Klasse I hochreguliert werden. Das Immunsystem spielt eine wesentliche Rolle in der Vernichtung von Tumorzellen und durch die Produktion von inflammatorischen Faktoren beeinflusst es auch den Krankheitsverlauf. Zytotoxische T-Lymphozyten, naturliche Killerzellen und T-Helferzellen tragen signifikant zur Eradikation von Tumorzellen bei. Es wurde von anderen Arbeitsgruppen gezeigt, dass NB-Zellen nur gering immunogen sind und daher dem Immunsystem ausweichen konnen. Die Rolle dieser Immunzellen in Therapie-induzierter Seneszenz beim Neuroblastom ist nicht bekannt. Unser Ziel war es zu analysieren, ob Seneszenz in MYCN amplifizierten NB-Zellen durch andere Medikamente, z.B. Camptothecin und Bromdesoxyuridin, in vitro schneller induziert werden kann als durch Behandlung mit Hydroxyurea und wie diese Medikamente im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen das Wachstumsverhalten, die Proliferation, MYCN Kopien Zahl, den GD2 Gehalt und die CD44 und MHC Klasse I Tumormarker Expression verandern. Um zu analysieren, welche molekularen Wege der Seneszenz Induktion durch Behandlung mit den verschiedenen Medikamenten zugrunde liegen, haben wir die p16, p53 und CDK2 Expression mittels Western Blot bestimmt. Weiters haben wir in einer Co-Kultur erforscht, ob seneszente NB-Zellen die Proliferation und die Tumormarker Expression von nicht-seneszenten Zellen in der Umgebung beeinflussen. Daruber hinaus haben wir auch Co-Kulturen mit nicht-seneszenten bzw. seneszenten NB-Zellen und TZellen angesetzt, um herauszufinden, ob seneszente NB-Zellen die Proliferation von T-Zellen erlauben. 4 Wir konnten zeigen, dass Camptothecin und Bromdesoxyuridin Behandlung schon nach 3 Wochen zu Seneszenz in MYCN amplifizierten NB-Zellen in vitro gefuhrt hat. Dies konnte durch Untersuchung der Morphologie, SA-ƒÀ-Gal Farbung, Reduktion der MYCN Kopien Zahl und des GD2 Levels und einer Hochregulierung von CD44 und MHC I gezeigt werden. Diese Eigenschaften waren ahnlich wie bei den spontan seneszenten und Hydroxyurea behandelten seneszenten NB-Zellen. Weiterhin weisen unsere Daten, im Hinblick auf CD8+ und CD4+ T-Zellen, auf eine immunstimulierende Rolle der seneszenten NB Tumorzellen hin. Die Induktion von Seneszenz in MYCN amplifizierten NB-Zellen, durch Behandlung mit Medikamenten in geringen Konzentrationen, zeigt Potential im Hinblick auf Einschrankung des Tumorwachstums, Inhibierung des aggressiven Phanotyps in NB-Zellen und Erhohung der Immunogenitat von NB Tumorzellen. Diese Eigenschaften, die durch die Seneszenz Induktion ausgelost werden, konnten in der klinischen Anwendung wichtig sein, um ein Tumorrezidiv in NB Patienten zu verhindern.Cellular senescence, a state of permanent cell-cycle arrest, can be triggered by various types of intrinsic and extrinsic stress and is associated with tumour suppression. However, senescent cells remain metabolically active and produce many secreted factors, such as growth factors and cytokines, which affect nearby cells and may also promote their proliferation. Neuroblastoma (NB) is a tumour derived from cells of the sympathetic nervous system and comprises the most common extra cranial solid tumour of childhood. Amplification of the MYCN oncogene characterizes aggressive NBs and is a prediction marker for poor outcome. Recently, it was shown that in vitro 6-8 weeks hydroxyurea treatment is a potent senescence inducing application in MYCN amplified neuroblastoma cell lines, derived from the primary tumour of stage 3 or 4 patients. Senescent NB-cells decrease MYCN copy number and the NB tumour marker GD2, while the surface molecules CD44 and MHC class I are upregulated upon hydroxyurea treatment. The immune system plays an important part in eradication of tumour cells, but also by producing inflammatory signals and thus influencing disease progression. Cytotoxic T-lymphocytes, Natural killer cells and CD4+ T-cells significantly contribute to tumour cell erradication. It has been shown, that NB-cells are low immunogenic and therefore evade the immune system. The role of these immune cells in therapy-induced senescence in neuroblastoma is not known. We aimed to analyze, whether senescene in MYCN amplified NB-cells can be induced faster than with hydroxyurea by using drugs such as camptothecin and bromodeoxyuridine and how those drugs change the growth behaviour, proliferation, MYCN copy number, GD2 level and tumour marker expression CD44 and MHC class I compared to control cells. In order to analyse the underlying cellular pathways leading to senescence by these different drug treatments we have evaluated p16, p53 and CDK2 by western blot. Furthermore, we studied whether senescent NB-cells modulate proliferation and tumour marker expression of nearby non-senescent cells in co-culture. Additionally, we co-cultured T-cells with non-senescent and senescent NB-cells to see whether senescent NB-cells allow T-cell proliferation. We could show, that camptothecin and bromodeoxyuridine treatment induced senescence already after 3 weeks in MYCN amplified NB-cells in vitro, proved by morphology, SA-β-Gal staining, MYCN copy number reduction, GD2 level decrease and CD44 and MHC I upregulation which was similar to spontaneous senescent and hydroxyurea treated senescent NB-cells. Moreover, our data suggest an immune-stimulatory role of senescent tumour cells with respect to CD8+ and CD4+ T-cells. Inducing senescence in MYCN amplified neuroblastoma cells by low-dose drug-treatment in vitro has the potential to restrict tumour growth, inhibit the aggressive phenotype in NB-cells and render tumour cells immunogenic. These features of senescence induction could be important in clinical applications to prevent tumour relapse in NB patients