Humoral and cellular characterization of minor allergens in birch pollen

Allergische Erkrankungen haben in urbanen Regionen epidemische Ausmaße angenommen und beeinträchtigen die Lebensqualität der betroffenen Personen. Pollen von windbestäubenden Pflanzen wie der Europäischen Weiss-Birke (Betula verrucosa) gehören in Mittel- und Nordeuropa zu den potentesten Allergenquellen. Birkenpollen enthält das gut charakterisierte Hauptallergen Bet v 1 sowie mehrere Nebenallergene, die von weniger als 50% der Birkenpollen-Allergiker erkannt werden. Diagnose und Therapie von Typ I Allergien hängen von der Qualität der verwendeten Allergenextrakte ab. Dabei können Defizite wie Chargenvariabilität oder unterschiedliche Konzentrationen verschiedener Komponenten auftreten. Diese können durch die Verwendung rekombinanter Allergene überwunden werden. Die wichtigsten Ziele dieser Arbeit waren i) die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung der Birkenpollen-Nebenallergene Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7 und ii) die Isolierung und Charakterisierung von T-Zell-Klonen (TCC) spezifisch für Birkenpollen Proteine. Alle Nebenallergene wurden in E.coli mit einem His-Tag exprimiert und mittels Ni- Affinitätschromatographie aufgereinigt. Der LPS-Gehalt wurde auf vernachlässigbare Mengen reduziert. Die korrekte Faltung und Allergenizität wurde durch IgE ELISA-Experimente mit Seren von Birkenpollen-Allergikern getestet. Die Fähigkeit Birkenpollen-spezifische T-Zellen zu aktivieren wurde durch Proliferationsassays mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC), allergen-spezifischen T-Zell-Linien (TCL) und T-Zell-Klonen von Birkenpollen-Allergikern ermittelt. Alle rekombinanten Allergene konnten IgE-Antikörper binden und Proliferation in PBMC induzieren. Allergen-spezifische TCC wurden aus Birkenpollen-spezifischen TCL isoliert und anhand von Proliferationsassays charakterisiert. Marker für T-Zellen und spezifische T-Zell Subtypen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zusätzlich wurden Zytokinkonzentrationen in Überständen von aktivierten Allergen-spezifischen TCC durch Bead-Arrays bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Mehrzahl der mit Birkenpollenextrakt expandierten TCC und TCL spezifisch für Bet v 1 waren und diese mehrheitlich zum TH2 Subtyp gehörten. TCC die nicht mit Bet v 1 reagierten gehörten großteils zum TH0 Subtyp. Ein TCC war spezifisch für das Nebenallergen Bet v 2. Kein Klon reagierte mit den rekombinanten Allergenen Bet v 3-7. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden endotoxinfreie Chargen von Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 und Bet v 7 hergestellt und deren IgE-Reaktivität bestätigt. Zum ersten Mal konnte die T-Zell-aktivierende Fähigkeit dieser Nebenallergene gezeigt werden. 89 In Zukunft könnten die produzierten und charakterisierten Allergene helfen, die immonologischen Unterschiede zwischen Bet v 1 und den identifizierten Nebenallergenen im Birkenpollen aufzuklären. Darüber hinaus könnten die eingefrorenen TCC hilfreich bei der Suche nach neuen Proteinen von immunologischen Wert im Birkenpollen sein.Allergic diseases have reached epidemic dimensions in urban areas and reduce the patients´ quality of life. Pollen from wind pollinated plants is among the most potent allergen sources. Pollen from the European white birch Betula verrucosa contain the well characterized major allergen Bet v 1 and several minor allergens which are recognized by less than 50% of birch pollen-allergic patients. Diagnosis and therapy of Type I allergy depends on the quality of the employed allergen extracts. Disadvantages such as batch to batch variability or standardization of the concentration of different components in allergen extracts may be overcome by the use of recombinant allergens. The major aims of this thesis were i) the expression, purification and characterization of the minor birch pollen allergens Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7 and ii) the isolation and characterization of T-cell clones (TCC) specific for proteins in birch pollen. All minor allergens were expressed in E.coli with a His-tag and purified by Ni- affinity chromatography. The LPS content was reduced to negligible levels. Correct folding and allergenicity of the allergens was tested by IgE ELISA experiments conducted with sera from birch pollen-allergic patients. The ability of the allergens to activate birch pollen-specific T-cells was assessed in proliferation assays using peripheral blood mononuclear cells (PBMC), allergen-specific T-cell lines (TCL) and TCC derived from birch pollen-allergic patients. All recombinant minor allergens were able to bind IgE antibodies and induced proliferation in PBMC from birch pollen-allergic patients. Allergen specific TCC were expanded from birch pollen-specific TCL and characterized in proliferation assays. Various subset-specific markers as well as molecules up regulated by specific activation were analyzed by flow cytometry. Cytokine levels in the supernatants of allergen-activated TCC were determined by cytokine bead arrays. Our results demonstrate that the majority of the TCC isolated from TCL expanded with birch pollen extract were specific for Bet v 1 and belonged to the TH2-like subset. TCC non-reactive with Bet v 1 belonged to the TH0-subset. None of the clones reacted with the recombinant minor allergens Bet v 3-7. One TCC was found to be Bet v 2-specific. In summary, endotoxin free batches of recombinant Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6 and Bet v 7 were produced and their IgE reactivity was confirmed. For the first time, the T-cell activating capacity of these minor allergens was shown. In the future, the produced and characterized allergens may help to examine the differences between Bet v 1 and minor allergens. Furthermore, the stored TCC are valuable in the search for new proteins with immunological value in birch pollen