Cloning, characterization and function analysis of bHLH transcription factor in Artemisia annua L.

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素(倍半萜内酯类化合物)是一种抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿中青蒿素的含量较低（0.01%-0.8%），导致青蒿素类抗疟药物的成本较高，而疟疾的流行区域又主要分布在发展中国家。为了降低青蒿素类抗疟药的价格，可以利用植物基因工程技术来提高青蒿素的含量，但青蒿素的生物合成途径仍不完全清楚，本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了青蒿素生物合成相关基因的分离及功能分析等工作，取得的主要结果如下： 青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS)和细胞色素P450 单加氧酶（CYP71AV1）是青蒿素生物合成的关键酶。ADS 基因和CYP71AV1 基因的启动子含有E-box 顺式元件，是bHLH 转录因子的结合位点。 我们从青蒿腺毛（青蒿素合成和积累的主要部位）的cDNA 文库中分离到两个bHLH 转录因子基因，分别命名为AabHLH1和AabHLH2。 AabHLH1编码一个约650 个氨基酸的蛋白，包含一个保守的bHLH结构域。AabHLH1和ADS受脱落酸和真菌诱导子壳聚糖的诱导。以GFP为报告基因的瞬时表达分析表明，AabHLH1 定位于细胞核。凝胶阻滞实验和酵母单杂交分析显示AabHLH1 能结合E-box 顺式元件。在AabHLH1瞬时转化青蒿叶片的实验中，AabHLH1能够调控青蒿素合成途径中的关键酶基因，并能激活ADS 基因和CYP71AV1 基因的启动子。上述结果表明AabHLH1能调控青蒿素的生物合成。 从青蒿分泌腺毛cDNA文库中分离到的AabHLH2基因编码一个约265个氨青蒿bHLH 家族转录因子克隆与功能分析基酸的蛋白，包含一个保守的bHLH结构域。AabHLH2和ADS受脱落酸和真菌诱导子壳聚糖的诱导，在根、茎、叶、花中均有表达。以GFP 为报告基因的瞬时表达分析表明，AabHLH2 定位于细胞核。蛋白质序列分析说明AabHLH2 不能结合E-box元件。在青蒿叶片的瞬时表达实验中AabHLH2只对青蒿醛Δ11(13)还原酶（DBR2）有调控作用