Effect of aqueous, methanolic and ethyl acetate extract of Origanum vulgare ssp. hirtum on type 1 diabetes induced by multiple low doses of streptozotocin in C57BL/6 mice

Dijabetes tip 1 (DT1) je autoimunsko oboljenje koje nastaje kao rezultat uništavanja insulin-produkujućih beta ćelija pankreasa od strane inflamacijskih medijatora. Uništavanje beta ćelija pankreasa dovodi do smanjene sekrecije insulina i posledične hiperglikemije. Glavna odlika DT1 je insulitis- infiltracija ćelija imunskog sistema u pankreasna ostrvca. Prve ćelije koje infiltriraju pankreasna ostrvca su makrofagi. Smatra se da inflamacijski M1 makrofagi doprinose patogenezi DT1, dok anti-inflamacijski M2 makrofagi imaju protektivnu ulogu. Makrofagi aktiviraju autoreaktivne T limfocite- smatra se da su CD4+ i CD8+ T limfociti najvažnije efektorske ćelije u patogenezi DT1. U zavisnosti od citokina koje sekretuju ćelije imunskog sistema nastaju različite subpopulacije pomoćničkih T limfocita (Th) koje usmeravaju imunski odgovor u DT1 ka destruktivnom (Th1 i Th17) ili protektivnom (Th2 i Treg) odgovoru. Različiti efektorski mehanizmi ćelija imunskog sistema dovode do stvaranja inflamacijskog miljea u paknreasnim ostrvcima koji dovodi do apoptoze beta ćelija pankreasa i razvoja DT1. Terapija DT1 podrazumeva doživotno unošenje insulina. Kako ovo sa sobom nosi potencijal kratkoročnih i dugoročnih komplikacija, ulažu se veliki napori u pronalaženje novih, efikasnih terapija u lečenju DT1. Jedan od potencijalnih pristupa u lečenju DT1 je korišćenje biljaka i njihovih ekstrakata koji se od davnina koriste u tradicionalnoj medicini. Napredak istraživanja u ovoj oblasti doveo je do saznanja da različiti biofenoli koji ulaze u sastav biljaka mogu ostvariti povoljna dejstva na patogenezu različitih oboljenja, što stavlja biljke i njihove ekstrakte u fokus naučnih studija. Origanum vulgare ssp. hirtum (grčki origano) je biljka bogata fenolskim i estarskim jedinjenjima i koja se u tradicionalnoj medicini koristi kao antiseptik, kao i u lečenju stomačnih i respiratornih jedinjenja. Glavna do sada pokazana dejstva origana su anti-bakterijsko i antioksidantno, a pokazano je i anti-hiperglikemijsko dejstvo origana u modelu toksičnog DT1, što čini origano potencijalnim kandidatom za terapiju DT1. U ovoj studiji je po prvi put ispitivano dejstvo različitih ekstrakata origana (metanolni, vodeni i etil-acetatni) na razvoj DT1 izazvanog višestrukim malim dozama streptozotocina (VMDS) kod miševa C57BL/6. Ispitivani su ćelijski i molekulski mehanizmi dejstva ekstrakata origana na ćelije imunskog sistema i beta ćelije pankreasa in vitro i in vivo. Takođe su vršena in vitro i in vivo ispitivanja najobilnijih jedinjenja u sastavu ekstrakata origana kako bi se otkrio mogući aktivni princip ekstrakata origana. In vitro ispitivanja su pokazala da su ekstrakti, primenjeni u koncentracijama koje nisu bile citotoksične, promenili imunski odgovor makrofaga poreklom iz peritonealne tečnosti i limfocita izolovanih iz cervikalnih limfnih čvorova. Vodeni i etil-actetatni ekstrakti origana su smanjili inflamacijski potencijal makrofaga putem smanjene sekrecije azot monoksida (NO) (vodeni ekstrakt origana) i smanjene sekrecije inflamacijskog citokina IL-1β (vodeni i etil-acetatni ekstrakt origana), dok je metanolni ekstrakt origana smanjio sekreciju NO makrofaga, a povećao sekreciju citokina IL-1β i TNF. Metanolni i etil-acetatni ekstrakti origana su smanjili i inflamacijski kapacitet limfocita putem smanjene sekrecije citokina IL-2, IFN-γ i IL-17 (metanolni) i IFN-γ i IL-17 (etil-acetatni). Osim efekta na imunske ćelije, ekstrakti origana su ispoljili i citoprotektivno dejstvo na beta ćelije pankreasa in vitro. Naime, metanolni i vodeni ekstrakti origana su sprečili smrt beta ćelija pankreasa indukovanu citotoksičnim citokinima, dok je etil-acetatni ekstrakt origana ovaj efekat ispoljio u najnižim primenjenim koncentracijama. Metanolni ekstrakt origana je sprečio apoptozu beta ćelija indukovanu citokinima smanjenjem aktivnosti kaspaze 3. In vivo ispitivanja na animalnom modelu kod koga je DT1 indukovan VMDS pokazala su da je profilaktički tretman sa metanolnim i etil-acetatnim, ali ne i vodenim ekstraktom origana, sprečio nastanak DT1 kod miševa soja C57BL/6. Ovo je bilo podržano i očuvanjem broja i funkcije pankreasnih ostrvaca na fiziološkom nivou- metanolni i etil-acetatni ekstrakti origana su sprečili infiltraciju ćelija imunskog sistema u pankreasna ostrvca, a metanolni ekstrakt origana je inhibirao i produkciju pro-oksidativih medijatora i održao koncentraciju insulina na fiziološkom nivou. Terapijski treman sa metanolnim ekstraktom origana doveo je do prolaznog smanjenja incidence DT1 kod miševa. Ex vivo ispitivanja mehanizma dejstva ekstrakata origana na DT1 pokazala su da je metanolni ekstrakt origana sprečio nastanak DT1 direktnim dejstvom na Th17 ćelije i pomeranjem balansa od destruktivnog Th1/Th17 imunskog odgovora ka protektivnom Th2/Treg imunskom odgovoru. Sa druge strane, etil-acetatni ekstrakt origana je antidijabetogeno dejstvo ostvario umirivanjem inflamacijskog M1/Th1/Th17 imunskog odgovora, kao i pomeranjem funkcionalnog fenotipa makrofaga ka antiinflamacijskom M2 fenotipu. Ruzmarinska i salvijanolična kiselina, kao i karvakrol su supstance koje su najzastupljenije u metanolnom i etil-acetatnom ekstraktu origana. U ovoj studiji je pokazano da, uprkos ispoljavanju imunomodulatornog dejstva in vitro, nijedna od ovih supstanci nije uspela da spreči nastanak DT1 u VMDS animalnom modelu ove bolesti. Određivanje jednog ili više aktivnih principa metanolnog i etil-ecatatnog ekstrakta origana moglo bi biti predmet budućih istraživanja. Rezultati ove disertacije ukazuju na to da primena metanolnog i etil-acetatnog ekstrakta origana može biti pogodna u potencijalnom tretmanu DT1, kako u preventivnim tako i u kombinovanim terapijskim strategijama lečenja DT1.Type 1 diabetes (T1D) is autoimmune disorder which develops as a consequence of destruction of insulin-producing pancreatic beta cells which is induced by pro-inflammatory mediators. Beta cell destruction leads to impaired insulin production and loss of glucose homeostasis. The hallmark of T1D is formation of insulitis- immune cells infiltration in pancreatic islets. Macrophages are the first cells that infiltrate pancreatic islets. It is considered that proinflammatory M1 macrophages contribute to T1D pathogenesis, while antiinflammatory M2 macrophages play a protective roll in T1D development. Macrophages can activate autoreactive CD4+ and CD8+ T lymphocites that are considered to be key players in T1D pathogenesis. Cytokines produced by immune cells lead to differentiation of specific T helper cells (Th) subsets, that can be destructive (Th1 and Th17) or protective (Th2 i Treg) in T1D development. Immune cells, by vast effector mechanisms, lead to formation of inflammatory milleu around pancreatic islets which ultimately stimulates beta cell apopotosis. Treatment for T1D includes lifetime intake of insulin which can potentially cause a number of short- and long term complications. This is why scientists invest significant efforts in developing new therapeutic approaches for T1D treatment. Plants and their extracts are promising candidates for treatment of T1D, due to their rich content of phenolic compounds which are proven to be beneficial for human health. Origanum vulgare ssp. hirtum (Greek oregano) is native plant rich in phenolic and ester compounds. It is used in traditional medicine as antiseptic, as well as in the treatment of respiratory and stomach ailments. Main known activities of oregano are antibacterial and antioxidant. Also, recently is reported anti-hyperglycaemic activity of oregano in the model of toxic diabetes. These facts make oregano a promising candidate for the treatment of T1D. This study for the first time investigates the effect of different oregano extracts (methanolic, aqueous and ethyl acetate) on multiple low doses streptozotocin (MLDS)-induced T1D in C57BL/6 mice. Also, cellular and molecular mechanisms of oregano extracts action on immune cells (macrophages and lymphocytes) and pancreatic beta cells were investigated both in vitro and in vivo. Additionaly, the effects of specific predominant substances found in oregano extracts on T1D pathogenesis were explored. Oregano extracts, in non-cytotoxic concentrations, showed immunomodulatory effects in vitro. Aqueous and ethyl acetate oregano extracts decreased inflammatory macrophage potential by reducing secretion of nitric oxide (NO) (aqueous oregano extract) and proinflammatory citokine IL-1β (aqueous and ethyl acetate oregano extracts). On the other hand, methanolic oregano extract decreased secretion of NO, while increasing secretion of IL-1β and TNF. Also, methanolic and ethyl acetate oregano extracts reduced in vitro lymphocite secretion of cytokines IL-2 (methanolic oregano extract), IFN-γ and IL-17 (methanolic and ethyl acetate oregano extracts). Besides the effect on immune cells in vitro, oregano extracts exhibited cytoprotective effects on pancreatic beta cells in vitro, protecting them from death induced by cytotoxic cytokines. MEO inhibited beta cell apoptosis by reducing acitivity of caspase 3. Prophylactic treatment with methanolic and ethyl acetate, but not aqueous oregano extract, reduced incidence of MLDS induced T1D in C57BL/6 mice. This was accompanied by preservation of beta cell number and function- methanolic and ethyl acetate oregano extracts inhibited infiltration of immune cells in pancreatic islets, while methanolic oregano extract also augmented production of oxidative mediators and kept insulin levels in the physiological range. Therapeutic treatment of T1D with methanolic oregano extract showed only transient effects. Detailed investigation of oregano extracts mechanisms of action showed that methanolic oregano extract ameliorated T1D by direct effect on Th17 cells and by shifting the balance from proinflammatory Th1/Th17 immune response towards protective Th2/Treg immune response. Ethyl acetate oregano extract, on the other hand, inhibited T1D by attenuating inflammatory M1/Th1/Th17 immune response, and by shifting macrophages towards protective M2 functional phenotype. Rosmarinic and salvianolic acid, as well as carvacrol, are most prevalent substances in methanolic and ethyl acetate oregano extracts. Although they showed immunomodulatory effects in vitro, they failed to protect mice from T1D development in vivo. Determination of one or more active principles of methanolic and ethyl acetate oregano extracts could be the subject of future studies. Results of this dissertation implicate methanolicic and ethyl-acetate oregano extracts as new potential candidates in the treatment of T1D, both in the preventive or combined therapeutic strategies.