Investigation of the prognostic value of matrix 2 and 9 metalloproteinase expression in patients with laryngeal squamous cell carcinoma

Maligni tumori larinksa čine 1-2% svih malignih tumora u humanoj populaciji. Planocelularni karcinom larinksa je češći u muškoj, nego u ženskoj populaciji, javljajući se obično između pete i sedme decenije života. Najznačajniji etiološki faktori za karcinom larinksa su pušenje duvana, konzumacija alkoholnih pića, gastroezofagealni refluks, infekcije HPV virusom, aerozagađenje, ishrana siromašna voćem i povrćem. Prognoza laringealnog karcinoma zavisi od regionalne zahvaćenosti malignom bolešću, odnosno stadijuma bolesti, koji se određuje na osnovu TNM (Tumour Node Metastasis) klasifikacije. Vreme preživljavanja se značajno smanjuje razvojem i širenjem bolesti (lokoregionalne ili udaljene metastaze). Poslednjih godina, istraživanja na molekularnom nivou otkrila su mnoge mehanizme onkogeneze. Ekspresija specifičnih tumor markera je povezana sa razvojem bolesti i biološkim ponašanjem karcinoma larinksa. Identifikacija prognostičke vrednosti nekih tumor markera bila bi od velike pomoći u odabiru terapijskog modaliteta, koji je od krucijalnog značaja za prognozu bolesti. Matriks metaloproteinaze (MMP) su familija od 23 endopeptidaze, strukturno vrlo slične proteolitičkim enzimima koji imaju sposobnost razgradnje komponenti ekstracelularnog matriksa. Stoga, MMP igraju važnu ulogu u progresiji i metastaziranju kancera. Povišene nivoe MMP se mogu detektovati u tumorskom tkivu i serumu pacijenata sa uznapredovalim karcinomom. MMP se mogu podeliti u šest subgrupa. MMP-2 i MMP-9 imaju sposobnost da unište kolagen tip IV, koji čini važnu komponentu bazalne membrane. Ovo je ključni momenat, koji je neophodan za tumorski rast i metastaziranje. Neki publikovani radovi su pokazali da MMP-2 i MMP-9 mogu igrati važnu ulogu u progresiji planocelularnog karcinoma regije glave i vrata. Identifikacija pacijenata sa visokim rizikom za razvoj maligniteta, prisustvo naknadnog lokoregionalnog recidiva, kao i postojanje regionalnih metastaza veoma su važni za prognozu bolesti, kao i za izbor najboljeg načina lečenja. Cilj ovog istraživanja je bio da proceni klinički značaj MMP-2 i MMP-9 ekspresije u tkivnim uzorcima planocelularnog karcinoma larinksa, poredeći glotični i subglotični subregion. U istraživanje je bilo uključeno ukupno 140 bolesnika, od toga 70 sa patohistološki verifikovanim planocelularnim karcinomom larinksa i 70 sa hroničnim laringitisom. Ispitanici sa karcinomom larinksa su razvrstani po grupama u odnosu na: lokalizaciju tumora u larinksu (supraglotična, glotična); TNM stadijuma bolesti (T1/T2, T3/T4, N0 odnosno N+, M0 odnosno M+); stadijum bolesti (I, II, III i IV); stepen diferentovanosti ćelija tumora (dobro, umereno, slabo); načina ćelijskog rasta (vegetantni, infiltrativni, mešoviti); razvoj lokoregionalnog recidiva (sa ili bez recidiva bolesti); prisustva perineuralne invazije (sa ili bez perineuralne invazije); prisustva limfovaskularne invazije (sa ili bez limfovaskularne invazije); petogodišnje preživljavanje (sa ili bez petogodišnjeg preživljavanja). Pacijenti sa karcinomom larinksa su dijagnostikovani, lečeni i praćeni u periodu od minimum 5 godina, između 2010. i 2017. u Klinici za otorinolaringologiju. Kontrolnu grupu su činili pacijenti kod kojih je, u istom periodu, dijagnostikovan i lečen hronični laringitis. Patohistološka verifikacija tumora larinksa i imunohistohemijske analize vršene su u Institutu za patologiju, od strane istih, iskusnih patologa. Kriterijum za uključivanje u studiju su bili patohistološki verifikovani planocelularni karcinomi larinksa i patohistološki verifikovane hronične promene u laringealnoj sluznici. Kriterijumi za isključenje iz studije su bila druga maligna oboljenja, prethodno sprovedena zračna ili polihemioterapija ili već ranije izvršeno hirurško uklanjanje tumora. Zatim, sistemske bolesti sa zahvatanjem larinksa, benigni pseudotumori larinksa. Prosečna starost pacijenata je bila 59,41 (±7,1), sa rasponom od 40 do 79 godina. Bilo je 60 (85,7%) muškaraca i 10 (14,3%) žena. Karcinom glotične regije bio je zastupljen kod 45 (64,3%) pacijenata, prosečne starosti 59,7 (±6,8) godina, a supraglotičnog regiona kod 25 (35,7%) pacijenta, prosečne starosti 58,8% (±7,7). Većina pacijenata sa glotičnim karcinomom bili su u T1/T2 stadijumu bolesti, dok je većina pacijenta sa supraglotičnim karcinomom bila u T3/T4 stadijumu. Nije otkrivena značajna razlika u petogodišnjem preživljavanju između pacijenata sa glotičnim i supraglotičnim karcinomom. Rezultati su pokazali značajnu višu MMP-2 i MMP-9 ekspresiju i u epitelu i u stromi tkivnih uzoraka karcinoma larinksa oba subregiona u poređenju sa pacijentima koji su imali hronični laringitis. Rad je pokazao da nivo ekspresije epitelijalne MMP-2 nije u korelaciji sa T, N ili kliničkim stadijumom bolesti i petogodišnjim preživljavanjem. Kod supraglotičnih karcinoma, MMP-2 je bila u korelaciji sa prisustvom perineuralne i limfovaskularne invazije. Uočena je i povezanost između epitelijalne MMP-2 ekspresije i pojave lokalnog recidiva karcinoma supraglotične lokalizacije. Takođe, nađena je negativna korelacija između histološkog stadijuma supraglotičnog karcinoma i nivoa ekspresije MMP-2. Što se tiče tumorskog rasta, otkrivena je statistička značajnost. MMP-2 ćelijska ekspresija je u direktoj korelaciji sa vegetativnim tumorskim rastom glotičnih karcinoma. Istraživanje nije otkrilo povezanost između epitelijalne MMP-9 ekspresije i nekih kliničkopatoloških karakteristika (T stadijum, N stadijum, klinički ili histološki stadijum) niti korelaciju sa DFI i petogodišnjim preživljavanjem. Epitelijalna MMP-9 ekspresija je u značajnoj korelaciji sa prisustvom limfovaskularne invazije i sa vegetantnim načinom rasta glotičnih tumora. Kod pacijenata sa karcinomom supraglotične lokalizacije, nisu nađeni slične relacije. Nije detektovana statistički značajna korelacija između ekspresije MMP-9 u epitelijalnim ćelijama i perineuralnom invazijom kod karcinoma larinksa. Ovo istraživanje je pokazalo visoku ekspresiju MMP-2 i MMP-9 i u epitelu i stromi pacijenata sa planocelularnim karcinomom u poređenju sa pacijentima sa hroničnim laringitisom. Naši rezultati ukazuju da bi MMP-2 ekspresija mogla poslužiti kao potencijalni parametar za otkrivanje pacijenata sa supraglotičnim karcinomom larinksa, koji su u visokom riziku za razvoj perineuralne i limfovaskularne invazije, odnosno razvoj lokalnog recidiva bolesti. MMP-9 ekspresija bi mogla biti prediktor vegetantnog načina tumorskog rasta i prisustva limfovaskularne invazije u karcinomu glotične sublokalizacije.Laryngeal malignant tumours consist about 1-2% of all malignant tumours in human population. Laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) is more common in male than in female population, occuring usually between the fifth and seventh decade of life. The most important etiological factors for LSCC are tobacco smoking, consumption of alcoholic drinks, gastroesophageal reflux, human papilloma virus (HPV) infections, air pollution, a diet low in fruits and vegetables. Prognosis of LSCC depends on the regional involvement of malignant disease, actual stage of disease, which can be determined by Tumour Node Metastasis (TNM) classification. Survival is significantly reduced due to the cancer development and spread of disease (local or regional recurrence and of distant metastasis occurrence). In recent years, molecular investigations have discovered many mechanisms of oncogenesis in malignant tumours. Expression of the specific tumour markers is associated with disease development and biological behavior of laryngeal carcinoma. Prognostic value identification of some tumour markers would be of great help in selecting treatment modalities, which is of crucial significance for prognosis of disease. Matrix metalloproteinases (MMPs) are family of 23 endopeptidases, structurally very similar proteolytic enzymes which have ability to degrade extracellular matrix components. Thus, MMPs play important role in tumour progression and metastasis. Elevated levels of MMPs can be detected in tumour tissue and serum of patients with advanced cancer. MMPs can be divided into 6 subgroups. MMP-2 and MMP-9 have ability to destroy the type IV collagen, which is a very important component of basement membrane. This is a key moment, which is necessary for tumour growth and distant metastasis. Some published papers showed that MMP-2 and MMP-9 may play important roles in progression of head and neck squamous cell carcinoma. Identification of patients with high risk for tumour development, the presence of subsequent locoregional tumour recurrence, as well as the existence of regional metastases are very important for prognosis of disease, as well as for the choose the best treatment modality. The purpose of the investigation was to evaluate the clinical significance of MMP-2 and MMP-9 expression in tissue samples of patients with LSCC, comparing glottic and supraglottic region of larynx. This study included a total of 140 patients, 70 with histologically verified LSCC and 70 with chronic laryngitis. Patients with malignant tumour were divided into groups with respect to: localization in larynx (supraglottic, glottic); TNM stage of disease (Т1/Т2, Т3/Т4, N0, N+, M0, M+); disease stage (I, II, II, IV); degree of tumour differentiation (good, moderate, poor); type of tumour growth (infiltrative, exophytic, mixed); development of loco-regional recurrence (with or without disease recurrence); the presence of perineural invasion (with or without of perineural invasion); lymphovascular invasion (with or without lymphovascular invasion) and 5-year survival (with or without 5-year survival). The patients diagnosed, treated and followed-up for a period of minimum 5 years between 2010 and 2017 for LSCC in Department of Otorhinolaryngology. The control group consisted of patients diagnosed and treated for chronic laryngitis in the same period. Pathological and immunohistochemical analyses of tissue specimens were performed at the Institute for Pathology by the same experienced pathologist. Criteria for inclusion in the study were histologically verified LSCC and histologically verified chronic inflammatory changes in laryngeal mucosa. Criteria for exclusion from the study were other malignant diseases, previous radiotherapy or chemotherapy, previously performed surgical treatment of laryngeal tumour. Then, systemic diseases affecting the larynx, laryngeal benign pseudotumours. The mean patients’ age was 59.41 (±7.1) years, range from 40–79 years. There were 60 (85.7%) male and 10 (14.3%) female patients. There were 45 (64.3%) patients with glottic SCC, mean age 59.7 (±6.8) years and 25 (35.7%) with supraglottic SCC, the mean age of 58.8 (±7.7). The majority of patients with glottic SCC were in T1/T2 stage, whereas the majority of supraglottic SCC patients were in T3/T4 stage. There is no significant difference regarding the 5-year survival between glottic and supraglottic SCC. Results revealed significantly higher MMP-2 and MMP-9 expression in both epithelium and stromal tissue specimens of patients with glottic and supraglottic SCC in comparison to patients with chronic laryngitis. Study showed that epithelial MMP-2 expression is not in correlation with T, N or clinical stage and 5-year survival. In supraglottic SCC, the MMP-2 epithelial expression was in correlation with the presence of perineural and lymphovascular invasion. It was noticed a correlation between the epithelial MMP-2 expression and local recurrences of the primary supraglottic cancer. Also, a negative significant correlation was recorded between the MMP-2 epithelial expression and histological stage in supraglottic SCC. According to the tumor growth pattern, it was demonstrated a statistical significance. The MMP-2 tumor cell expression was in correlation with the presence of exophytic type of tumour growth in glottic SCC. The present study revealed no correlation between the epithelial MMP-9 expression and some clinicopathological characteristics (T stage, N stage, clinical or histological stage) nor the correlation with diseasefree interval and 5-year survival. Epithelial MMP-9 expression significantly correlates with the presence of lymphovascular invasion and with the presence of exophytic type of the tumor growth in glottic SCC. In patients with supraglottic localization of SCC, there were no similar relationships. It was found no statistical relationship between the expression of MMP-9 in epithelial cells and perineural invasion in the laryngeal SCC. This study demonstrated higher expression of MMP-2 and MMP-9 in both epithelium and stroma of patients with LSCC in comparison to patients with chronic laryngitis. The results suggest that MMP-2 expression can serve as a potential parameter for detection of patients with supraglottic SCC who are at high risk for perineural and lymphovascular invasion and developing disease recurrence. MMP-9 expression can be a strong predictor for the presence of exophytic type of tumour growth, as well as for the presence of lymphovascular invasion in glottic SCC