Fibrinolytic mechanism disorders in patients withvenous thrombosis

Tromboza danas, u većini razvijenih zemalja, predstavlja vodeći uzrok obolevanja i umiranja. Poslednjih godina veoma aktuelna su istraživanja venskog tromboembolizma, obzirom da je incidenca ovog oboljenja 2/1000 osoba godišnje, a njegov razvoj posledica udruženog delovanja više genetskih i stečenih faktora rizika. Što preciznije prepoznavanje i sagledavanje što većeg broja ovih faktora osnovni je cilj u borbi, kako protiv prve epizode venske tromboze, tako i protiv recidiva ove bolesti. Brojni faktori rizika već su prepoznati kao sastavne karike patofiziološkog lanca venskog trombotskog procesa, ali je evidentno da otkrića mnogih od njih tek predstoje. Među najaktulenijim istraživanjima na ovom polju nalazi se i ispitivanje uloge poremećaja fibrinoliznog mehanizma u venskoj tromboembolijskoj bolesti. Iako su već pruženi dokazi da suprimirana fibrinolizna aktivnost povećava rizik od nastanka ovog oboljenja, još uvek postoje brojna otvorena pitanja, koja se pre svega odnose na ulogu pojedinačnih činilaca fibrinoliznog mehanizma u venskoj trombozi, kao i na globalnu ulogu fibrinoliznog mehanizma u različitim tipovima i lokalizacijama venske trombotske bolesti. Pored toga, ispitivanje uticaja pojedinih genskih mutacija na pojadinačne činioce fibrinoliznog mehanizma, njegovu globalnu funkcionalnost i posredno na rizik za nastanak venske tromboze, takođe zaokuplja pažnju stručne javnosti, obzirom na nekonzistentnost rezultata dobijenih studijama koje se bave ovom problematikom. Cilj ovoga istraživanja je ispitivanje kako globalne funkcionalnosti fibrinoliznog mehanizma, tako i njegovih pojedinačnih činilaca, kod bolesnika sa različitim tipovima i lokalizacijama venske tromboze i poređenje ovih parametara sa njihovim vrednostima u zdravoj populaciji. Pored toga, cilj istraživanja je i ispitivanje zastupljenosti 4G/5G PAI-1 polimorfizma kod bolesnika sa venskom trombozom u poređenju sa zdravim osobama. Ispitivanu grupu je sačinjavalo 100 bolesnika koji su doživeli trombozu dubokih vena a kontrolnu grupu je činilo 100 zdravih ispitanika, koji nikada nisu imali trombozni incident. Iz ispitivanja su isključene: osobe sa prethodno dokazanim poremećajem hemostaznog mehanizma, osobe koje uzimaju lekove za koje se zna da mogu imati uticaja na hemostazni mehanizam, osobe koje su imale akutnu bolest u momentu uzorkovanja krvi ili 6 nedelja pre toga, osobe sa malignitetom, trudnice, osobe sa težim duševnim bolestima, bolestima jetre i bubrega, autoimunim bolestima, ispitanici koji su odbili da potpišu pristanak informisanog ispitanika. Kao test za procenu globalne funkcionalnosti fibrinoliznog mehanizma korišteno je euglobulinsko vreme lize koaguluma, dok su od pojedinačnih činilaca određivani: tkivni aktivator plazminogena (t-PA) i trombinom aktivišući fibrinolizni inhibitor (TAFI) - ELISA metodom, kao i inhibitor aktivatora plazminogena-1 (PAI-1) - metodom hromogenog substrata. Genetskim ispitivanjem je utvrđivano prisustvo PAI-1 4G/5G genskog polimorfizma. Prema rezultatima istraživanja kod 56% bolesnika bila je prisutna spontana venska tromboza, dok je 44% njih imalo trombozu provociranu jednim od priznatih faktora rizika. U odnosu na lokalizaciju venskog tromboznog procesa proksimalna venska tromboza bila je prisutna kod 63% bolesnika, izolovana distalna venska tromboza kod 29% bolesnika, a atipično lokalizovana venska tromboza kod 8% bolesnika. Posmatrajući zastupljenost pojedinih faktora rizika uočili smo da je značajno viši procenat osoba sa hipertenzijom bio prisutan u grupi bolesnika sa primarnom trombozom dubokih vena u odnosu na grupu bolesnika sa provociranom trombozom dubokih vena (61% vs.16%; p=0.000). Što se funkcionalnosti fibrinoliznog mehanizma tiče, prema našim rezultatima bolesnici koji su doživeli trombozu dubokih vena imaju značajno duže vreme lize koaguluma, odnosno suprimiranu funkcionalnost fibrinolize u poređenju sa zdravim kontrolama (204.34±51.24 vs. 185.62±42.30; p=0.011), a kada posmatramo podgrupe bolesnika u odnosu na lokalizaciju i vrstu venske tromboze uočavamo da podgrupa bolesnika sa izolovanom distalnom venskom trombozom ima značajno duže euglobulinsko vreme lize koaguluma u odnosu na kontrolnu grupu (218.32±41.12 vs.185.62±42.30: p=0.001), kao i bolesnici koji su imali provociranu vensku trombozu u poređenju sa kontrolama (208.18±48.53 vs. 185.62±42.30; p=0.018). Ispitivanjem pojedinačnih komponenti fibrinoliznog mehanizma došli smo do rezultata da bolesnici koji su doživeli venski trombozni incident imaju značajno više koncentracije TAFI u poređenju sa osobama koje nikada nisu imale vensku trombozu (19.70 ng/ml ± 5.17 vs.17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.001). Poređenjem bolesnika sa provociranom trombozom dubokih vena i kontrolnih ispitanika uočili smo da bolesnici iz ove podgrupe imaju značajno više vrednosti plazminogena u poređenju sa zdravim osobama (127.14 % ± 27.73 vs.117.09 % ± 24.49; p= 0.044), kao i značajno više koncentracije t-PA (20.02 ng/ml ± 11.07 vs. 16.78 ng/ml ± 8.08; p=0.042). Što se tiče TAFI, bolesnici sa distalnom trombozom dubokih vena u poređenju sa kontrolama (20.72 ng/ml ± 4.96 vs.17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.001), kao i bolesnici sa proksimalnom trombozom dubokih vena u poređenju sa kontrolama (19.37 ng/ml ± 5.33 vs.17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.013) imaju značajno više koncentracije TAFI. Koncentracija ovog inhibitora fibrinoliznog procesa značajno je veća i kod bolesnika sa provociranom trombozom dubokih vena u poređenju s zdravim osobama (19.93 ng/ml ± 3.97 vs.17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.000), kao i kod bolesnika sa primarnom trombozom dubokih vena u poređenju sa zdravim ispitanicima (19.53 ng/ml ± 5.97 vs.17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.023). Što se genetskih analiza tiče, u okviru grupe bolesnika imali smo 25% homozigotnih i 58% heterozigotnih nosilaca mutacije gena za PAI-1, dok 17% bolesnika nije imalo pomenutu gensku mutaciju. U okviru kontrolne grupe pak, bilo je 30% homozigotnih i 56% heterozigotnih nosilaca mutacije a 14% ispitanika nije imalo mutaciju. Nije uočena značajna razlika u zastupljenosti 4G/4G genotipa između bolesnika sa različitim lokalizacijama venskog trombotskog procesa (distalna DVT 29% vs. proksimalna DVT 21% vs. DVT retke lokalizacije 12%; p=0.501), kao ni u zastupljenosti ovoga genotipa kod provocirane i spontane tromboze dubokih vena (27% vs. 23%; p=0.642), niti kod izolovane tromboze dubokih vena u poređenju sa plućnom tromboembolijom (25% vs. 33%; p=0.735). Procena rizika za nastanak venske tromboze u odnosu na postojanje poremećaja globalne funkcionalnosti fibrinoliznog mehanizma, u odnosu na patološke koncentracije pojedinih komponenti fibrinoliznog mehanizma, kao i u odnosu na postojanje 4G/4G mutacije u genu za PAI-1, pokazala je da suprimirana funkcionalnost fibrinoliznog mehanizma trostruko povećava rizik za nastanak tromboze dubokih vena (OR 3.02; CI 1.26-7.22), povišen nivo PAI-1 nema uticaja na rizik od nastanka tromboze dubokih vena, na šta ukazuje OR od 0.86 sa CI 0.59-1.25, povišen nivo t-PA antigena ne utiče na rizik od nastanka tromboze dubokih vena (OR 1.53; CI 0.79-2.94), ali povišena koncentracija TAFI više od dvostruko povećava ovaj rizik (OR 2.25; CI 1.16-4.35). Prema našim rezultatima PAI-1 4G/4G genotip nema uticaja na rizik od nastanaka venske tromboze, što potvrđuje OR koji iznosi 0.57 (0.27-1.20). Na osnovu dobijenih rezultata zaključujemo da bolesnici sa trombozom dubokih vena imaju suprimiranu funkcionalnost fibrinoliznog mehanizma u poređenju sa zdravim osobama, da je nivo t-PA antigena, kao i plazminogena značajno viši kod bolesnika sa provociranom venskom trombozom nego kod zdravih osoba, da nema razlike u koncentraciji PAI-1 između bolesnika sa venskom trombozom i zdravih osoba, ali da bolesnici sa trombozom dubokih vena, bez obzira na njenu lokalizaciju ili vrstu imaju značajno više nivoe TAFI u poređenju sa zdravim ispitanicima. Pored toga možemo zaključiti da ne postoji razlika u zastupljenosti 4G/5G polimorfizma između bolesnika sa venskom trombozom i zdravih ispitanika. Konačno, možemo reći da na osnovu naših rezultata možemo zaključiti da suprimirana funkcionalnost fibrinoliznog mehanizma trostruko povećava rizik od nastanka tromboze dubokih vena, a povišen nivo TAFI-a dvostruko povećava ovaj rizik, dok 4G/5G PAI-1 polimorfizam nema uticaja na rizik za nastanak venskog tromboembolizma.Thrombosis is nowadays leading cause of morbidity and mortality worldwide. Lately, studies dealing with venous thromboembolism are very actual, since incidence of this disease is 2/1000 persons per year and its development is consequence of joint action of many different inherited and acquired risk factors. Precise recognition and understanding as many of those factors as possible represents imperative in fight against the first episode of venous thrombosis, and also against the recurrence of the disease. Numerous risk factors have been already recognized as constituent links of pathophysiological chain of venous thrombotic process, but it is also clear that the discovery of many of them are yet to come. Investigations of the role of fibrinolytic mechanism disorders in venous thrombosis are topical in the field. Although, we have some evidences that suppressed fibrinolytic activity increases the risk of this disease, still there are many open issues, especially those dealing with the role of individual factors of fibrinolytic mechanism in venous thrombosis, and with the role of global fibrinolytic function in different types and localizations of venous thrombotic disease. Further, investigation of the effects of gene mutations on individual fibrinolytic mechanism components, its global functionality and indirectly to the risk of venous thrombosis, also attracts the attention of experts, given the inconsistency of results obtained from studies dealing with this issue. The aim of this study was to evaluate fibrinolytic mechanism global functionality, as well as functionality of its integral individual components in patients with different venous thrombosis types and localizations, and to compare them with those of the healthy persons. In addition, the aim was to evaluate presence of 4G/5G PAI-1 polymorphism in patients with venous thrombosis compared with healthy subjects. The case group consisted of 100 patients with deep vein thrombosis and the control group consisted of 100 healthy subjects who had never had thrombotic incident. Exclusion criteria were: documented haemostatic disease, taking drugs proven to affect fibrinolytic function, acute illness within 6 weeks before blood sampling, malignancy, pregnancy, severe mental illness, kidney or liver diseases, autoimmune diseases, examinee refusal to sign the informed consent. We used euglobulin cloth lysis time test as test for global fibrinolytic mechanism function estimation, and also determined: t-PA and TAFI concentrations using ELISA method and PAI-1 concentrations using chromogenic substrate method. The presence of PAI-1 4G/5G gene polymorphism was determined by genetic testing. According to results 56% of patients had unprovoked and 44% had provoked venous thrombosis. Proximal venous thrombosis was present in 63% of cases, distal venous thrombosis in 29% of cases and atypical venous thrombosis in 8% of them. Significantly higher frequency of hypertension was present in patients with primary deep vein thrombosis than in the group of patients with provoked deep vein thrombosis (61% vs. 16%, p = 0.000). Patients who have experienced deep vein thrombosis had a significantly longer clot lysis time, and suppressed fibrinolysis function compared with healthy controls (204.34 ± 51.24 vs. 185.62 ± 42.30, p = 0.011). Also, this parameter was significantly longer in patients with isolated distal deep vein thrombosis compared with healthy controls (218.32±41.12 vs. 185.62±42.30: p=0.001), such as in patients with provoked venous thrombosis compared with controls (208.18±48.53 vs. 185.62±42.30; p=0.018). Patients with venous thrombosis had significantly higher TAFI concentrations in comparison with healthy volunteers (19.70 ng/ml ± 5.17 vs. 17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.001). Patients with provoked venous thrombosis had significantly higher concentrations of plasminogen (127.14 % ± 27.73 vs. 117.09 % ± 24.49; p= 0.044) and t-PA (20.02 ng/ml ± 11.07 vs. 16.78 ng/ml ± 8.08; p=0.042), in comparison with controls. Regarding TAFI, we noticed that patients with isolated distal deep vein thrombosis have higher values of this parameter compered with healthy people (20.72 ng/ml ± 4.96 vs. 17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.001), such as patients with proximal deep vein thrombosis (19.37 ng/ml ± 5.33 vs. 17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.013). The same was obtained when compared patients with provoked venous thrombosis and controls (19.93 ng/ml ± 3.97 vs. 17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.000), and patients with unprovoked venous thrombosis and controls (19.53 ng/ml ± 5.97 vs. 17.13 ng/ml ± 4.25; p=0.023). As far as genetic analysis, in the group of patients we had 25% homozygous and 58% heterozygous carriers of PAI-1 gene mutation, whereas 17% of patients did't have this mutation. In controls, we had 30% homozygous and 56% heterozygous carriers of mutation and 14% of those without mutation. There was no significant difference in the frequency of 4G/4G genotype between patients with different localization of venous thrombotic process (distal DVT 29% vs. proximal DVT 21% vs. rare localization DVT 12%, p = 0.501), as well as the representation of this genotype in provoked and unprovoked deep vein thrombosis (27% vs. 23%, p = 0.642), or in isolated deep vein thrombosis compared to pulmonary thromboembolism (25% vs. 33%, p = 0.735). Finaly, our results show that suppressed fibrinolytic functionality threefold increases risk of venous thrombosis (OR 3.02, CI 1.26-7.22), elevated levels of PAI-1 have no effect on the risk of deep vein thrombosis, as evidenced by OR of 0.86 with CI 0.59-1.25, elevated levels of t-PA antigen do not affect the risk of deep venous thrombosis (OR 1.53; CI 0.79-2.94), but increased concentration of TAFI increases more than twice this risk (OR 2.25; CI 1.16-4.35). PAI-1 4G/4G genotype does not affect venous thrombotic risk (OR 0.57; CI 0.27-1.20). Based on these results, we conclude that patients with deep vein thrombosis have suppressed fibrinolytic mechanism functionality compared to healthy subjects, the levels of t-PA antigen and plasminogen are significantly higher in patients with provoked venous thrombosis than in healthy subjects, there is no difference in PAI-1 concentration in patients with venous thrombosis and healthy persons, but the patients with deep vein thrombosis, regardless of its localisation or the type have a significantly higher level of TAFI as compared with healthy subjects. In addition, we can conclude that there is no difference in the prevalence of 4G/5G polymorphism in patients with venous thrombosis and healthy persons. Finally, we can say that suppressed fibrinolytic mechanism functionality threefold increases risk of deep vein thrombosis, elevated level of TAFI-a double increases this risk, while PAI-1 4G/5G polymorphism has no influence on the risk of venous thromboembolism