Études structurales par cryo-microscopie électronique d’un système d’efflux multi-drogues bactérien, impliqué dans la résistance aux antibiotiques

The increasing appearance of multi-drug-resistant pathogenic bacteria to most available antibiotics is emerging as a global public health problem. Unfortunately, excessive use in both human and animal medicine has led to the emergence of multi-drug-resistant strains for most antibiotics available on the market. It is therefore urgent to better understand the underlying mechanisms by which bacteria resist to antibiotics to combat multi-resistance strains. In this context, this work aims at better understanding the molecular basis of active drug efflux in Pseudomonas aeruginosa, which is one of the most important mechanisms used by the bacterium to resist to several antibiotics. Efflux systems form protein complexes in the bacterial wall and actively expel antibiotics even before they reach their intracellular target, rendering them inactive. The structural study focuses on the MexA-MexB-OprM RND (Resistance-Nodulation and cell Division) system that is constitutively expressed in wild-type bacteria and is over-expressed in resistant strains. This tripartite complex is composed of a transporter inserted into the inner membrane, a channel protein inserted in the outer membrane and a periplasmic adapter protein that connects the other two proteins to form a sealed conduit through the periplasm. In the absence of knowledge of the structure of the tripartite complex, the aim of the thesis was to develop an original strategy to reconstitute the whole complex in vitro in a lipid environment from the three native components produced separately.The assembly of the tripartite complex is made by mixing MexA with MexB and OprM in Nanodisc mimicking the two lipid bilayers. The structure of this tripartite complex was obtained by combining cryo electron microscopy and the so-called 'isolated particles' approach. The three-dimensional structure of the complex, calculated at a resolution of less than 4 Å, was used to build an atomic model of the tripartite complex assembled between two Nanodiscs. The tripartite complex is composed of an OprM trimer, a MexB trimer and a MexA hexamer surrounding MexB and interacting with OprM. We solve the complete structure of MexA whose N-terminal part hitherto unknown because of a high flexibility and describe for the first time the anchoring of MexA in a lipid membrane. The conformational changes are observed on OprM and MexB when they are assembled in the complex with the opening of the periplasmic end of OprM and the spatial re-orientation of a MexB loop to establish additional contact with MexA.To integrate this tripartite structure into the antibiotic efflux cycle, it describes a state that is probably a resting state, knowing that no specific ligand was added during assembly. In addition, the complex forms an open channel at its extracellular end, providing the conduit to evacuate the drugs carried by MexB that uses the proton motive force as a source of energy. This work opens new perspective for structural studies of other conformational states of the efflux system in "energized" conditions to fulfill our understanding of the efflux cycle mechanism. Moreover, the knowledge of this first tripartite native complex structure constitutes the first step towards the development of molecules capable of blocking the assembly of the complex for therapeutic uses. Indeed, such molecules would inhibit active efflux and restore the lost efficiency of current antibiotics.L'apparition croissante de bactéries pathogènes multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles apparaît comme un problème mondial de santé publique. Malheureusement, un usage excessif à la fois en médecine humaine et animale a conduit à l’apparition de souches multi-résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles sur le marché. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes mis en place par les bactéries pour résister aux antibiotiques afin de trouver des solutions pour combattre les souches multi-résistances.Dans ce contexte, le projet de la thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires de l’efflux actif de drogues chez Pseudomonas aeruginosa, qui est un des plus importants mécanismes utilisés par la bactérie pour lutter contre l’action de plusieurs antibiotiques. Les systèmes d’efflux forment des complexes protéiques situés dans la paroi de la bactérie et expulsent de manière active les antibiotiques avant même qu’ils aient pu atteindre leur cible intracellulaire, les rendant ainsi inactif.L’étude structurale se focalise sur le système RND (Resistance-Nodulation and cell Division) MexA-MexB-OprM qui est constitutivement exprimé chez la bactérie sauvage et est surexprimé chez les souches résistantes. Ce complexe tripartite est composé d'un transporteur inséré dans la membrane interne, d'une protéine canal insérée dans la membrane externe et d’une protéine adaptatrice périplasmique qui relie les deux autres protéines pour former un conduit étanche traversant le périplasme. En l’absence de la connaissance de la structure du complexe tripartite, l’objectif de la thèse a été de développer une stratégie originale pour reconstituer in vitro le complexe entier dans un environnement lipidique à partir des trois composants natifs produits séparément.L’assemblage du complexe tripartite est réalisé en mélangeant MexB et OprM en Nanodisque avec MexA mimant les deux bicouches lipidiques. La structure de ce complexe tripartite a été obtenu en combinant la cryo microscopie électronique et à l’approche dite ‘des particules isolées’. La structure tridimensionnelle du complexe calculée à une résolution inférieure à 4 Å a permis de construire un modèle atomique du complexe tripartite assemblé entre deux Nanodisques.Le complexe tripartite est composé d’un trimère d’OprM, d’un trimère de MexB et d’un hexamère de MexA entourant MexB et en interaction avec OprM. Ces données ont permis de résoudre la structure complète de MexA dans le complexe dont la partie N-terminale jusqu’alors inconnue car trop flexible et décrivent pour la première fois l’ancrage de MexA dans une membrane lipidique. Les changements conformationnels sont observés sur OprM et MexB lorsqu’ils sont engagés dans le complexe avec l’ouverture de l’extrémité périplasmique d’OprM et le basculement d’une boucle de MexB permettant d’établir un contact supplémentaire avec MexA.Pour replacer cette structure tripartite dans le cycle d’efflux de l’antibiotique, celle-ci décrit un état qui s’apparente probablement à un état au repos, sachant qu’aucun ligand spécifique n’a été ajouté au cours de l’assemblage. De plus, le complexe forme un canal ouvert à son extrémité extracellulaire, fournissant le conduit pour évacuer les drogues transportées par MexB qui utilise la force protomotrice comme source d’énergie.Ce travail ouvre la perspective à des études structurales d’autres états conformationnels du système d’efflux en condition « énergisé » pour compléter la compréhension du mécanisme du cycle d’efflux. Par ailleurs, la connaissance de cette première structure du complexe natif tripartite constitue le premier pas vers le développement de molécules capables de bloquer l’assemblage du complexe à des fins thérapeutiques. En effet, de telles molécules inhiberaient l’efflux actif et restauraient l’efficacité perdue des antibiotiques actuels