Criblage de mutants d'Arabidopsis et caractérisation du mutant dgl1

La paroi forme une matrice composée essentiellement de polysaccharides qui s’avère déterminante pour la morphologie et la croissance des végétaux. A ce jour, malgré ce rôle de la paroi dans le développement des végétaux, presqu’aucune activité enzymatique (glycosyltransférase ; GT) impliquée dans sa biosynthèse n’a été caractérisée. Afin de détecter des mutants d’Arabidopsis déficients pour ces activités GT, des stratégies de crible biochimique basées sur l’analyse de la paroi ont été développées. Nous avons démontré que l’analyse par chromatographie en phase gazeuse du contenu en monosaccharide de paroi de plantules étiolées d’Arabidopsis fournit des informations reproductibles, imformatives et quantifiables permettant la sélection de mutant arborant des altérations de leur paroi. Par ailleurs, une stratégie innovante d’analyse d’un polymère pariétal, le xyloglucane (XG), par empreinte enzymatique a été développée et validée à l’aide de mutants présentant des variations quantitatives/qualitatives de ce polymère. Cette stratégie permet après une préparation rapide du matériel pariétal, d’hydrolyser le XG par une endoglucanase et d’analyser les fragments oligosaccharidiques par chromatographie, électrophorèse ou spectrométrie de masse. Ces stratégies, appliquées à de nouveaux mutants d’Arabidopsis, ont permis la sélection du mutant dgl1-1 sur la base d’une accumulation de glucose pariétal. L’analyse génétique a révélé l’altération d’une sous unité protéique du complexe oligosaccharyltransférase (OST) orthologue de la protéine humaine OST48, ou de levure WBP1, qui assure dans chacun de ces systèmes le transfert d’un N-glycanne précurseur sur un résidu asparagine durant la synthèse des protéines dans le RE. La détection d’une protéine du RE, la protéine disulfide isomérase (PDI), chez le mutant dgl1-1 a permis de démontrer l’altération de la N-glycosylation chez ce mutant. Un second allèle dgl1-2 a été caractérisé embryon létal. L’étude phénotypique par microscopie a montré de sévères altérations des parois cellulaires dans le cylindre central des plantules dgl1. Une caractérisation fine de la composition de la paroi chez le mutant a donc été entreprise, démontrant une accumulation de callose dans les tissus vasculaires en cours de différenciationThe plant cell wall is a highly organized matrix, mainly composed of polysaccharides, that is determinant for plant morphology and development. Strikingly little is known about the enzymes that control cell wall biosynthesis and deposition. The characterization of Arabidopsis cell wall mutants is one of the more promising approaches to investigate the synthesis, transport and assembly of cell wall polysaccharides. However,the identification of new cell wall mutants from public collections is a major bottleneck. In this context, the aim of the PhD thesis was first to design new biochemical screening methodologies to detect Arabidopsis cell mutants and second to apply these methodologies to the selection of new mutants. We demonstrated that the quantification by gas chromatography of the monosaccharide contents of Arabidopsis seedling cell wall give reproducible and informative information allowing the selection of plants exhibiting cell wall alteration. Moreover, an innovative enzymatic fingerprinting strategy was developed and validated on previously characterized xyloglucan mutants. In this screening methodology, cell wall material has been treated by an endoglucanase and the generated fragments have been identified by chromatography,electrophoresis or MALDI-TOF mass spectrometry. These strategies have been used for the screening of new cell wall mutants. A mutant called defective glycosylation1-1 (dgl1-1) was identified in Arabidopsis based on a growth defect of the dark-grown hypocotyl and an abnormal composition of the non-cellulosic cell wall polysaccharides. dgl1-1 is altered in a protein ortholog of human OST48 or yeast WBP1, an essential protein subunit of the oligosaccharyltransferase complex that is responsible for the transfer in the ER of the N-linked glycan precursor onto Asn residues of candidate proteins. Consistent with the known function of the OST complex in eukaryotes, the dgl1-1 mutation led to a reduced N-linked glycosylation of the ER-resident protein disulfide isomerase (PDI). A second more severe allele (dgl1-2) was embryo-lethal. Microscopic analysis of dgl1-1 revealed severe developmental defects including a strongly reduced cell elongation and, collapse and Differentiation defects of cells in the central cylinder. These defects were accompanied by changes in the non-cellulosic polysaccharide composition, including the accumulation of ectopic callose. Interestingly, in contrast to other dwarf mutants that are altered in the early steps of the N-glycan processing, dgl1-1 did not exhibit a cellulose deficiency. Together these results confirm the role of DGL1 in N-linked glycosylation, cell growth and differentiation in plants