Fecundación en el anfibio Bufo arenarum : rol de las integrinas y proteínas de estrés térmico

La reproducción es un proceso biológico que permite la creación de nuevos organismos, siendo una característica común de todas las formas de vida conocidas. Las modalidades básicas de reproducción se agrupan en dos tipos: asexual o vegetativa y sexual o generativa. En todas las especies con reproducción sexual, el proceso de fecundación involucra varias etapas secuenciales en las cuales el espermatozoide debe interactuar con las distintas cubiertas que envuelven al ovocito. Múltiples estudios sugieren que las estrategias y moléculas que participan en el proceso de generación de un nuevo organismo a partir de dos células altamente diferenciadas, presentan un alto grado de conservación entre las distintas especies. Debido a esto, el análisis del proceso de fecundación en especies que se encuentran alejadas evolutivamente del humano puede brindar información no sólo de interés biológico, sino que permitirá, con el tiempo, conocer los detalles de cómo se da este proceso en nuestra especie. El propósito de este Trabajo de Tesis fue contribuir al conocimiento actual de la biología de la reproducción en cuanto a las moléculas involucradas en la interacción que ocurre entre las gametas a nivel de las membranas plasmáticas, utilizando como modelo al anfibio anuro Bufo arenarum. En particular, el objetivo propuesto fue profundizar el estudio de la participación de las integrinas y de las proteínas de estrés térmico pertenecientes a la subfamilia HSPA durante la fecundación. Las integrinas son heterodímeros formados por la unión no covalente entre dos tipos de subunidades: y . El estudio de la participación de estas proteínas durante la fecundación comenzó con el análisis de la expresión de diversas subunidades integrina tanto en ovocitos como en espermatozoides de Bufo arenarum. Experimentos de PCR e inmunodetección pusieron de manifiesto la presencia de las subunidades 5, V y 1 integrina en el ovocito y de la subunidad V integrina en el espermatozoide. Posteriormente, mediante ensayos de fecundación in vitro en presencia de un anticuerpo policlonal diseñado contra el dominio extracelular de la subunidad 1 integrina, se pudo determinar la participación de dicha subunidad en el proceso. Previamente, mediante inmunofluorescencia se había detectado la presencia de la subunidad 1 integrina en la membrana plasmática de cortes citológicos de ovocitos. Sin embargo, los resultados de inhibición de la fecundación debido a la presencia del anticuerpo anti 1 integrina no permitían determinar si dicha subunidad cumplía un rol meramente de adhesión o si también estaba involucrada en la cascada de transducción de señales propia de la fecundación. La comparación del patrón de fosforilación en residuos tirosina de muestras obtenidas a distintos tiempos (minutos) post-fecundación con la de ovocitos tratados con el péptido RGDS (motivo reconocido por numerosas integrinas) permitió inferir que las integrinas median eventos de transducción de señales desde la membrana plasmática del ovocito hacia el interior celular luego de la interacción con el espermatozoide. Sin embargo, no todos los cambios observados luego de la fecundación pudieron ser mimetizados mediante el tratamiento de los ovocitos con el péptido. Este resultado, junto con los obtenidos en experimentos anteriores realizados por nuestro grupo, nos permitió concluir que el péptido RGDS no sería capaz de provocar la activación de los ovocitos de Bufo arenarum. Sin embargo, nos sugirió que algunas señales, aunque no suficientes para activar el metabolismo del ovocito, sí podrían provenir de la señalización mediada por integrinas. El patrón de fosforilacion en restos tirosina común a ambas condiciones (minutos post-fecundación y tratamiento con RGDS) incluyó tres proteínas con pesos moleculares aparentes de 30, 60 y 70 kDa. En el contexto de la bibliografía existente, decidimos analizar la posible identidad de la proteína que presentaba un peso aparente de 70 kDa. Mediante experimentos de PCR realizados sobre ADNc obtenido de ovocitos detectamos la presencia de ARNm que codifican para la proteína Spleen Tyrosine Kinase (SYK), lo que hasta el momento no había sido descripto en ovocitos de vertebrados. Posteriormente, se analizaron muestras obtenidas a distintos tiempos post-fecundación con anticuerpos capaces de reconocer formas fosforiladas en residuos tirosina de la proteína SYK. Se pudo comprobar así, que esta proteína no sólo estaría presente en el ovocito de B. arenarum sino que también se activaría pocos minutos después de la fecundación. En conjunto nuestras evidencias nos permitirían sugerir que la proteína SYK sería parte de la cascada de señalización que se desencadena luego de la interacción que ocurre entre las membranas plasmáticas de las gametas. En cuanto a las proteínas de estrés térmico de la subfamilia HSPA, se determinó la expresión de dichas proteínas en ambas gametas de B. arenarum, hallándose de manera ubicua en el ovocito, y en una ubicación más acotada (acrosoma y pieza media) en el espermatozoide. Mediante ensayos de fecundación in vitro en presencia de un anticuerpo policlonal diseñado contra HSPA se pudo demostrar la participación de esta proteína en la fecundación de B. arenarum. Quizás el resultado más novedoso fue que por primera vez se obtuvieron evidencias acerca de la difusión de la proteína de estrés térmico HSPA desde la membrana plasmática del ovocito y/o alguna de sus cubiertas hacia el medio externo durante la deposición de las gametas. Los resultados presentados en esta Tesis demuestran, a su vez, la unión de esta chaperona liberada con los espermatozoides de B. arenarum. También se determinó que como consecuencia de esta unión se produce un aumento en la viabilidad de los mismos (usando como indicador la integridad de la membrana plasmática). Esta estrategia le permitiría a un mayor número de espermatozoides llegar a encontrarse con los miles de ovocitos que son liberados por la hembra, y de esta manera generar un gran número de embriones. Debido a las condiciones adversas que enfrenta la descendencia de los organismos que presentan fecundación externa, la maximización del número inicial de embriones es central para la supervivencia de la especie, ya que sólo algunos llegan al estadio adulto.Fil: Mouguelar, Valeria. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina