Caracterización de un minibiorreactor con funciones de hígado bioartificial : estudios del componente celular y variables de operación

La Falla Hepática Aguda (FHA) es un desorden complejo y devastador que afecta a pacientes sin enfermedad hepática preexistente. Es una patología de rápida progresión, asociada con una alta tasa de mortalidad [13]. Actualmente, el único tratamiento efectivo disponible es el Trasplante Hepático Ortotópico (THO). El número de trasplantes hepáticos que se lleva a cabo en la actualidad se mantiene estable, mientras que el número de pacientes en lista de espera para un nuevo órgano se sigue incrementando. Por ello, uno de los principales problemas a los que se enfrenta hoy en día esta terapia lo constituye la escasez de órganos. Con el fin de evitar el desarrollo de complicaciones o la muerte de pacientes durante el período de espera, se están evaluando diferentes opciones alternativas al tradicional THO. Entre estas, destacan los hígados bioartificiales (HBA). Los HBA son dispositivos extracorporales que constan de tejido hepático o de hepatocitos funcionales (el componente biológico), alojado dentro de un biorreactor fabricado por el hombre (el componente sintético o artificial) y separado de la circulación sanguínea por membranas semipermeables [26]. Una de las claves para el óptimo rendimiento de un HBA es la correcta elección del componente biológico. A su vez, la arquitectura del biorreactor debe adecuarse al componente biológico elegido, permitiendo el acceso del mismo a los nutrientes necesarios para llevar a cabo funciones hepato-específicas. Finalmente, una vez seleccionado el componente biológico y diseñado el modelo de biorreactor a escala de laboratorio, el sistema debe validarse, chequeando su habilidad para sostener una buena viabilidad y funcionalidad del componente biológico elegido. Dentro de este marco, nos planteamos el objetivo de desarrollar un prototipo de biorreactor que pueda ser utilizado como dispositivo de asistencia extracorporal para soporte de la función hepática, principalmente, en casos de FHA. En primer lugar, seleccionamos como componente biológico para nuestro sistema a los microórganos hepáticos (MOHs), que son cortes de hígado, tipo láminas, de unos 400 μm de espesor, que mantienen la micro-arquitectura básica del lobulillo hepático y, por lo tanto, conservan sus características fisiológicas. Esta elección se fundamentó en el hecho de que se considera que el componente biológico “ideal” para ser aplicado a un HBA debe ser aquel que tenga en su composición todos los tipos de células hepáticas, con el objetivo de obtener una máxima respuesta. Una vez seleccionado el componente biológico, se optimizó el método de obtención y corte manual de los mismos, obteniéndose MOHs de un espesor de 338 ± 27 μm (n=25), valor que se encuentra dentro del rango óptimo (mayor a 200 μm y menor a 500 μm) indicado en la literatura [39]. Para que el HBA se convierta en una herramienta terapéutica útil es necesario desarrollar algún método de preservación del componente biológico, que permita mantenerlo viable y funcional, de manera de poder utilizarlo clínicamente cuando sea requerido. El método elegido en este trabajo de tesis fue la preservación por isquemia fría: almacenamiento estático, en frío (0 a 4 °C), en anoxia (bajo atmósfera de N2) y en una solución especialmente diseñada para tal fin [52]. Para poder contar con una solución adecuada para la preservación de MOHs, nuestro equipo de trabajo desarrolló la solución BG35 [58]. En este trabajo de tesis se profundizó en el estudio de la preservación de MOHs de rata en esta solución BG35, haciendo hincapié en la evaluación del metabolismo de amonio durante la etapa de reoxigenación. Esto se debe a que, previo a su uso en un HBA, es fundamental constatar que el componente biológico elegido mantenga su capacidad para detoxificar amonio, ya que la acumulación en sangre de dicho metabolito es el principal agente causal de los daños neurológicos asociados a la FHA [13]. Para ello, tanto MOHs frescos (recién cortados) como los MOHs preservados en BG35 y ViaSpan® (solución Gold Standard), luego de las 48 h de almacenamiento en frío, fueron evaluados en un sistema in vitro de reoxigenación normotérmica, en el que se tomaron muestra a los tiempos 0, 60 y 120 min. Los MOHs preservados en BG35 mantuvieron valores similares a los de MOHs frescos para todos los parámetros de viabilidad (liberación de LDH y contenido de glucógeno) y funcionalidad (consumo de oxígeno y contenido de agua total) evaluados. En cuanto a los parámetros ensayados sobre el metabolismo de amonio, a pesar de algunas diferencias observadas en los niveles de transcripto y de actividad enzimática para Carbamil Fosfato Sintetasa I y Ornitina Transcarbamilasa, las dos principales enzimas del ciclo de la urea, los MOHs preservados en BG35 fueron capaces de detoxificar amonio y sintetizar urea de manera similar a MOHs frescos y preservados en ViaSpan®, luego de 120 min de reoxigenación. Esto los hace aptos para ser utilizados como componente biológico en un HBA. Una vez optimizados los métodos de obtención y preservación del componente biológico, se desarrollaron dos prototipos de minibiorreactores (MBR), uno de cuerpo cilíndrico y el otro con un cuerpo de basa plana. Ambos modelos tienen una capacidad de 45 cm3 y permiten un intercambio correcto de fluidos y metabolitos entre los compartimientos biológico y sanguíneo. En la construcción de los dos prototipos se utilizaron fibras de PolyamixTM, obtenidas a partir de cartuchos de diálisis comercializados por la firma GAMBRO®, que posibilitan un adecuado transporte difusivo y convectivo de solutos a través de sus paredes. En la etapa final de validación, se analizaron diferentes parámetros de viabilidad y funcionalidad para MOHs utilizados como componente biológico en nuestros MBR. En el modelo cilíndrico, los MOHs frescos no fueron capaces de detoxificar amonio, mientras que si pudieron hacerlo en el MBR de base plana, lo que demuestra la importancia de la arquitectura y la configuración del componente artificial en el diseño de un HBA. Por otro lado, los MOHs preservados en BG35 mostraron un porcentaje de liberación de LDH, un mantenimiento de su integridad morfológica y una capacidad para detoxificar amonio similar a los controles al desempeñarse como componente biológico en el MBR de base plana. En base a todos los resultados enunciados anteriormente podemos concluir que: Nuestra técnica manual de corte se ha optimizado y validado, ya que permitió obtener MOHs de rata de un espesor adecuado y con una alta reproducibilidad. La solución BG35, desarrollada en nuestro laboratorio, permite que MOHs de rata almacenados 48 h en hipotermia mantengan niveles de viabilidad y funcionalidad similares a los de MOHs frescos durante todo el período de reoxigenación normotérmica. Los MOHs preservados en solución BG35 mantuvieron una adecuada capacidad para detoxificar amonio durante la reoxigenación, lo que posibilita su uso como componente biológico en un sistema de HBA. El poseer un método eficaz de preservación para nuestro componente biológico nos permite contar con el mismo en cantidad y calidad, y en el momento en el que sea necesario. Los MBR diseñados como parte de este trabajo de tesis muestran un adecuado funcionamiento in vitro en lo que respecta a intercambio de fluidos y metabolitos, no observándose pérdidas ni interacciones inespecíficas de los compuestos evaluados (glucosa y amonio) con alguno de sus componentes. En el desarrollo de un HBA, la arquitectura del MBR debe adecuarse a las necesidades del componente biológico para lograr un óptimo desempeño del mismo, tal como se ha demostrado en esta tesis. El MBR de base plana tiene un diseño sencillo y está construido con materiales estándar. Además de su uso como parte de un HBA, podría utilizarse como una herramienta de laboratorio útil para investigar los efectos de diferentes protocolos de preservación, criopreservación o cultivo sobre las funciones sintéticas o de detoxificación de MOHs provenientes de diferentes fuentes. Nuestro prototipo ha superado con éxito la etapa de validación in vitro, lo que posibilita continuar con las siguientes fases de escalado y evaluación en modelos animales.Fil: Pizarro, María Dolores. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Centro Binacional (Argentina-Italia) de Investigaciones en Criobiología Clínica y Aplicada; Argentina