Determinación de marcas epigenéticas en genesimplicados en la respuesta temprana a Botrytis cinerea de Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum

Existen en estudios recientes realizados en plantas, evidencias que vinculan la presencia de modificaciones epigenéticas con su respuesta a estreses bióticos. Sin embargo, dentro de estos estreses no se encuentra a penas información sobre patógenos necrótrofos. En esta tesis se exploran las posibles alteraciones en la estructura cromatinica que plantas de las especies Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum (tomate) podrían experimentar en varios de sus genes expresados en la respuesta a la infección por Botrytis cinerea, un hongo necrótrofo. Se plantea para ellos la puesta a punto de un protocolo de extracción de cromatina y de inmunoprecipitación de la misma (ChIP) y, se relatan las dificultades derivadas de un patosistema de estas características, en las que el patógeno genera tejido necrótico a medida que avanza. Una vez obtenidos los protocolos funcionales, se analizan diversas modificaciones epigenéticas; concretamente de la hisona 3, entre ellas: algunas que se han relacionado con activación transcripcional como H3K4me3, H3K9ac y otras relacionadas con represión como H3K27me3; por otreo lado se estudia la presencia de la RNAPII en algunas condiciones. Los resultados muestran, en plantas de A. thaliana infectada a dos tiempos, un enriquecimiento de estas marcas activadoras en la zona del cuerpo y el promotor del gen AtPR1 (marcador de activación de una de las principales rutas defensivas), así como empobrecimiento de la represora. Resultados similares se observan con otros genes inducidos como AtCYP71A13 o AtELI3, implicados en la síntesis de la fitoalexina camalexina y del polímero lignina respectivamente. Por otro lado, resultados diferentes se observan en genes con demostrada expresión reprimida durante la infección, como son AtEXL7 o AtBGLU23. Tras resolver ciertos problemas, se consigue también analizar algunas de estas modificaciones (las activadoras) en plantas de S. lycopersicum y, adicionalmente, se examina la presencia de la RNAPII. Se examinan también genes inducidos por la infección de este hongo, entre los que cabe destacar los involucrados en la síntesis de las oxilipinas (con importantes implicaciones defensivas), SlDES, SlLOXD y SlDOX1. Similarmente a lo visto en A. thaliana se ve un incremento en las marcas activadoras en distintas zonas de estos genes y, además, se observa como la presencia de la RNAPII a menudo acompaña a estas marcas. Estos resultados pueden ser utilizados para la determinación de otras modificaciones epigenéticas y otros genes, además del estudio de la posible herencia transgeneracional de dichas modificaciones. Por otro lado, muchos de los genes examinados en ambas especies son biomarcadores potenciales de infección temprana en el patosistema S. lycopesicum-B. cinerea, lo que podría contribuir a su pronta detección en este cultivo y otros similares.There are recent studies carried out on plants, tha show evidences that link the presence of epigenetic modifications with their response to biotic stresses. However, within these stresses there is hardly any information about necrotrophic pathogens. This thesis explores the possible alterations in the chromatin structure that plants of the species Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum (tomato) could experience in several of their genes expressed in response to the infection by Botrytis cinerea, a necrotrophic fungus. The development of a chromatin extraction protocol and its immunoprecipitation (ChIP) is proposed in order to achieve this goal, and the difficulties derived from a pathosystem of these characteristics are reported, in which the pathogen generates necrotic tissue as it advances . Once the functional protocols have been obtained, various epigenetic modifications are analyzed; specifically of hisona 3, among them: some that have been related to transcriptional activation such as H3K4me3, H3K9ac and others related to repression such as H3K27me3; On the other hand, the presence of RNAPII is studied in some conditions. The results show, in plants of A. thaliana whose samples have been collected in different stages of the infection, an enrichment of these activating marks in the area of ​​the body and the promoter of the AtPR1 gene (marker of activation of one of the main defensive pathways), as well as impoverishment of the repressor. Similar results are observed with other genes induced as AtCYP71A13 or AtELI3, involved in the synthesis of the phytoalexin camalexin and the lignin polymer respectively. On the other hand, different results are observed in genes with demonstrated repressed expression during infection, such as AtEXL7 or AtBGLU23. After solving certain problems, it is also possible to analyze some of these modifications (activators) in plants of S. lycopersicum and, additionally, the presence of RNAPII is examined. Genes induced by the infection of this fungus are also examined, among which are those involved in the synthesis of oxilipins (molecules with important defensive implications), SlDES, SlLOXD and SlDOX1. Similar to that seen in A. thaliana, there is an increase in the activating marks in different areas of these genes and, in addition, it is observed how the presence of the RNAPII often accompanies these marks. These results can be used for the determination of other epigenetic modifications and other genes, besides the study of the possible transgenerational inheritance of said modifications. On the other hand, many of the genes examined in both species are potential biomarkers of early infection in the S. lycopesicum-B patosystem. cinerea, which could contribute to its early detection in this crop and other similar ones