Characterization of novel insect cytochrome P450-fusion enzymes

Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYPs) bilden eine in vielen Organismen vorkommende Enzymgruppe mit einem großen Substratspektrum. Sie besitzen eine große Reaktionsvielfalt, wie zum Beispiel die Entgiftung von Insektiziden, was sie zu besonders interessanten Kandidaten für die industrielle Anwendung macht. Allerdings können CYPs auf Grund ihrer komplexen Eigenschaften, wie die Notwendigkeit einer Cytochrom-P450-Reduktase (CPR) für den Elektronentransfer von NADPH, nicht vollständig genutzt werden. Darüber hinaus sind CYPs und CPRs auf Grund ihrer Membrananker unlöslich. Diese zwei Faktoren stellen Herausforderungen für ihre artifizielle Produktion und anschließende Aufreinigungs- und Ganzzell-Anwendungen dar. Das Ziel dieser Studie war es, die genannten Schwierigkeiten durch die Konstruktion von CYP-Fusionsenzymen zu überwinden. Die Fusionsenzyme wurden auf Grundlage der bakteriellen CYP102A1 (BM3) aus Bacillus megaterium, einem natürlichen Fusionsenzym ohne Membrananker, konstruiert. Die generierten Fusionskonstrukte bestehen aus einer austauschbaren Insekten-CYP, einem variablen BM3-Linker, der BM3-CPR (BMR), und einem C-terminalem 6xHis-tag. Zum ersten Mal wurden drei verschiedene Insekten-Fusionsenzyme der CYP6-Familie (CYP6A1-BMR, CYP6G1-BMR und CYP6AE14-BMR) und der CYP4G-Unterfamilie (CYP4G1-BMR, CYP4G2-BMR und CYP4GF-BMR) konstruiert. Diese Fusion ermöglichte die rekombinante Insekten-CYP6-Produktion in Escherichia coli sowie die Aufreinigung ohne den Einsatz von Detergenzien. Mit dem Ziel die Fähigkeit der aufgereinigten Enzyme, die Oxidation der Substrate Imidacloprid und Aldrin, nachzuweisen, wurden passende LC- und GC-MS-Methoden für die Charakterisierung etabliert. Es wurde ein Ganzzell-Ansatz entwickelt, um den Aufreinigungsprozess als Grund für die CYP6-Inaktivität ausschließen zu können. In dieser Studie wurde gezeigt, dass die aus der Blaualge Nostoc punctiforme stammenden Enzyme Acyl-ACPReduktase und Aldehyddecarbonylase rekombinant zusammen in E. coli produziert werden können und, dass sie die von E. coli produzierten langkettigen Fettsäuren in langkettige Alkane umwandeln können. In einem nächsten Schritt wurde die Aldehyddecarbonylase durch ein CYP4G-Fusionskonstrukt ersetzt. Dadurch generieren die Acyl-ACP-Reduktase und das Fusionskonstrukt ein Ganzzell-System zur Alkanproduktion. Zur Detektion der Aldehyde und Alkane wurde eine SPME-GC-MS-Methode etabliert. Die Ergebnisse dieser Studie, welche die Konstruktion neuer Insekten-CYP-Fusionsenzyme, sowie die etablierten Methoden, dienen als Grundlage für die weitere Charakterisierung und biokatalytische Entwicklung von Insekten-CYPs