Identificação e clonagem de uma protease em uma biblioteca de cDNA da interação Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa

O fungo Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer (= Crinipellis), agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), é atualmente o maior problema fitopatológico das regiões produtoras de cacau. A complexidade do patossistema cacau-M. periniciosa e os prejuízos causados pela vassoura-de-bruxa motivaram estudos genômicos e proteômicos do fungo e da interação. Em bibliotecas de cDNA das interações T. cacao-M. perniciosa resistente e suscetível, sequenciadas na UESC, foram detectados fragmentos de diferentes classes de proteases. Um gene de cisteíno-protease do tipo papaína (TcCisPr04) foi completamente seqüenciado. Esse gene possui uma ORF de 1068 pb, que codifica uma proteína com 356 aminoácidos, com peso molecular estimado de 39 kDa e pI de 5,43. A sequencia aminoacídica de TcCisPr04 foi alinhada com outras proteases e do gene bank e agrupou com cisteíno-proteases envolvidas em reação de hipersensibilidade a patógenos. Análises com o programa signalP 3.0 indicou que a proteína possui um peptídeo sinal com provável sitio de clivagem entre os aminoácidos 19 e 20 e análises com os programas TargetP e PSORT indicaram provável secreção para o apoplasto ou localização vacuolar. Análise no Pfam e ProDom indicou um domínio inibitório contendo 56 aminoácidos, na região amino-terminal e um domínio catalítico de 218 aminoácidos na região carboxi-terminal da proteína. O domínio inibitório da TcCisPr04 foi clonado em pET28a, sob controle do promotor da T7 RNA Polmerase e do Operador lac. A proteína correspondente foi expressa na estirpe de E. coli, BL21(DE3), e induzida com IPTG a 1 mM. A expressão heteróloga do domínio inibitório foi visualizada em gel SDS-PAGE 15% e uma banda com massa molecular esperada de aproximadamente 19 kDa foi observada. A proteína heteróloga purificada por cromatografia em colunas contendo níquel inibiu a atividade de papaína em ensaios com o substrato cromogênico BApNA. Os parâmetros cinéticos da inibição estão sendo determinados. Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESB e UESC. (Texte integral