Comparison of brain and cranial nerve morphology between eyed surface fish and blind cave fish of species Astyanax mexicanus

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013O Sistema Nervoso Central (SNC) de qualquer vertebrado desenvolve-se a partir de uma estrutura semelhante, fazendo uso dos mesmos factores. A placa neural embrionária, através da acção coordenada de Wnts, FGFs, Sonic Hedgehog e BMPs, é padronizada nos seus eixos Antero-Posterior e Dorso-ventral. Estes mesmos factores desencadeiam o desenvolvimento de organizadores secundários no sistema nervoso que vão actuando de uma forma gradualmente mais localizada. Como resultado, cinco vesículas cerebrais são formadas: Telencéfalo, Diencéfalo, Mesencéfalo, Metencéfalo e Mielencéfalo. Os mesmos factores actuam posteriormente no controlo da proliferação de células progenitoras neurais. Esta organização corresponde ao arquétipo cerebral de qualquer vertebrado a partir da qual toda a diversidade morfológica que se verifica na natureza é gerada. Pequenas modificações em qualquer um destes três momentos do desenvolvimento do SNC (padronização, regionalização e neurogénese, respectivamente) podem alterar a morfologia final do encéfalo. No caso dos teleósteos e peixes cartilagíneos, regiões específicas do cérebro apresentam expansões relativamente ao resto do cérebro conforme o input sensorial – a título de exemplo, os tubarões apresentam geralmente cerebelos mais desenvolvidos dado o grau de mecano- e electrorrecepção, enquanto teleósteos apresentam maiores expansões do tecto óptico, que responde ao input visual. Parece de facto haver uma correlação entre a alteração de diferentes regiões do cérebro e o nicho que as espécies ocupam. Estas observações estão de acordo com a hipótese de Evolução em Mosaico, que afirma que diferentes regiões do cérebro alteram-se conforme as exigências ecológicas do meio que a espécie ocupa. Esta teoria contrapõe-se à ideia de que constrangimentos no desenvolvimento do cérebro levam à modificação coordenada do desta estrutura como um todo. No entanto, para perceber como o SNC evolui, é necessário mais que descrever diferenças anatómicas e correlacioná-las com o meio. É igualmente indispensável entender quais os mecanismos responsáveis por estas alterações, quando é que estes foram modificados e que forças levaram à retenção dessas alterações. Infelizmente, os modelos animais mais utilizados não nos garantem respostas a todas estas perguntas. A espécie de teleósteo Astyanas fasciatus mexicanus é originária da América Central e é composta por populações de superfície com um fenótipo perfeitamente similar ao de outros peixes. Esta espécie apresenta também um morfotipo cavernícola que, embora tenha divergido significativamente do seu ancestral, não atingiu o isolamento reprodutor. É, portanto, possível gerar híbridos férteis ao cruzar ambos os morfotipos. A colonização das cavernas terá ocorrido há cerca de 8 milhões de anos, tendo havido segunda onda de colonização mais recente estimada nos 3 milhões de anos que originou outras populações. No meio cavernícola, as populações não são predadas e encontram-se num ambiente relativamente estável. Contudo, este ambiente pode ser particularmente hostil dada a falta de alimento durante a estação seca e à hipoxia do meio aquático. Todos estes factores poderão ter gerado pressões selectivas grandes o suficiente para permitir divergências genéticas e fenotípicas entre populações de superfície e cavernícolas. Não se pode excluir o papel da deriva genética, pois dada a escassez de alimento e o isolamento, é de prever que as populações estejam sujeitas à acção de bottlenecks periódicos, promovendo a erosão da diversidade genética destes grupos. Estas populações cavernícolas evoluíram independentemente um fenótipo convergente: perda de pigmentos, expansão da linha lateral craniana, maior número de papilas gustativas e degeneração dos olhos. Todas estas características, bem como a possibilidade de fazer análises moleculares, tornam esta espécie num excelente modelo para estudar evolução do SNC. A expansão da linha lateral permitiu aumentar a capacidade de mecanorrecepção deste morfotipo, compensando a perda da visão que é tradicionalmente considerada um sentido dominante em teleósteos. Sabendo que a degeneração dos olhos resultou numa redução do tecto óptico – região do cérebro que responde a estímulos visuais –, é expectável que o incremento no input proveniente da linha lateral tenha resultado em modificações de outras regiões do cérebro. Há, no entanto, várias outras modalidades sensoriais (olfacto, paladar, tacto) que poderão ter sido modificadas no ambiente cavernícola, à semelhança da linha lateral, permitindo que indivíduos consigam lidar com as adversidades deste meio. Qualquer informação sensorial é transmitida ao cérebro através de nervos cranianos. Estes são tipicamente doze, mas em vertebrados basais, como teleósteos, estes são dez (excluem-se os nervos XI, acessório e XII, hipoglossal). No entanto, dada a capacidade de mecanorrecepção deste grupo de vertebrados, estes possuem ainda os nervos anterior e posterior da linha lateral. No caso de Astyanax, sabe-se que houve uma redução do nervo óptico (II) – o que está em parte associado à redução do seu respectivo órgão sensorial. Nada se sabe em relação aos outros nervos. Desta forma, definimos como objectivo deste projecto descrever morfologia dos nervos cranianos e do cérebro em ambos os morfotipos, de forma a perceber como é que o ambiente cavernícola afectou quer o input sensorial quer os respectivos centros no cérebro. As medições foram realizadas em indivíduos criados no mesmo ambiente e em dois estadios, a cinco dias depois da fertilização (larvas) e a um ano de idade. A medição robustez dos nervos cranianos e o volume de diferentes regiões do cérebro nestes dois estadios permitiu comparar diferenças definidas durante o desenvolvimento e outras que pudessem aparecer mais tarde na ontogenia. As medições de volume do encéfalo foram feitas através de microtomografia computacional (micro-CT), uma técnica de imagiologia baseada em raios-X. Esta permitiu realizar reconstruções 3D do encéfalo dos peixes em ambas idades após um tratamento com ácido fosfotúngstico para marcar tecidos não mineralizados. Através destas reconstruções, foram medidos os volumes do cérebro, bolbo olfactivo, telencéfalo, tecto óptico, hipotálamo e cerebelo. Esta técnica permitiu ainda a medição dos nervos cranianos de espécimes adultos. Para medir e comparar nervos cranianos das larvas, fez-se um ensaio imuno-histoquímico para tubulina-α acetilada, marcando os axónios destes nervos para serem visualizados em microscopia confocal. As imagens obtidas foram usadas para fazer reconstruções 3D dos nervos cranianos de modo a medir as respectivas áreas de secção. Como resultado, reportamos que para além do nervo óptico, os nervos associados com os músculos do olho (oculomotor e troclear) têm também um menor diâmetro no morfotipo cavernícola. Para além disto, os nervos trigémeo e linha lateral anterior têm uma maior área de secção no mesmo morfotipo, representando um possível incremento no input somato- e mecanossensorial, respectivamente. O cérebro da forma cavernícola aparenta ter um menor volume que o dos peixes de superfície, o que pode representar uma adaptação importante ao ambiente hipóxico e à falta de recursos alimentares. Ao contrário do que sugerido por trabalhos anteriores e contra as expectativas de uma coordenação entre modificações sensoriais e cerebrais, o telencéfalo, hipotálamo e cerebelo aparentam ser relativamente menores neste morfotipo. Verificou-se que o tecto óptico, a região do cérebro que responde ao input visual, se encontra subdesenvolvido. Isto é verificado ainda na fase larvar, evidenciado que esta redução pode ser uma característica já fixa no código genético da população cavernícola. O bolbo olfactivo aparenta representar uma maior fracção do cérebro no morfotipo cavernícola. Muito embora a análise efectuada não revele diferenças no hipotálamo, telencéfalo e cerebelo deste morfotipo, é importante referir que trabalhos anteriores descrevem alterações no número de neurónios que constituem os núcleos cerebrais nos peixes cavernícolas, causando modificações comportamentais. Assim, nesta fase incipiente do processo de especiação, as principais diferenças no SNC de ambos os morfotipos podem assentar nos diferentes núcleos cerebrais, sendo estas talvez mais relevantes para garantir a sobrevivência da forma cavernícola num ambiente hostil.Understanding how the brain evolves in response to new environmental situations is key to comprehend not just the developmental mechanisms underlying the generation of variability in brain patterns, but also to understand how the animal’s perception and mental representation of their environment evolves. With this idea in mind, we described the differences in cranial nerve and brain morphology between the eyed surface form and the blind cave of Astyanax fasciatus mexicanus using micro-CT technology. This is, to our knowledge, the first time this method is employed for neuroanatomical studies. Comparisons were performed at both five day old and one year old fish. Our results show a topological conservation of cranial nerves in both morphotypes with significant reductions in visual related nerves in the cavefish along with a reduction in the optic tectum. We also found an increased robustness of the trigeminal and anterior lateral line nerves, responsible for somato- and mechanosensory input, respectively. At 5 dpf the surface fish brain is bigger than the cavefish and no differences were found between different regions. The overall adult brain volume of cavefish is approximately 20% smaller in the cavefish, which is also accompanied by a reduction of its telencephalic, hypothalamic and cerebellar regions. The olfactory bulb appears to circumvent this trend, showing signs of enhancement. This overall reduction shows that energetic constraints may be of significance in shaping the overall morphology of the brain the cave environment