Experimental validation of new drugs for calorie restriction from computational models

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012O envelhecimento é um dos problemas mais graves que o mundo desenvolvido enfrenta no século XXI. Para a Ciência, o desafio é não só encontrar maneiras de aumentar a esperança de vida, mas também a qualidade de vida, particularmente em idades mais avançadas. A Restrição Calórica (CR) é a limitação do consumo de calorias, sem provocar malnutrição. Há mais de 75 anos que se sabe que esta intervenção é capaz de aumentar a longevidade. Ao longo dos anos, ficou claro também que a CR diminui o risco para doenças relacionadas com o envelhecimento. Experiências num número muito variado de espécies mostraram que o efeito da CR é conservado desde a levedura até aos mamíferos. Estudos em humanos têm um grande número de limitações que não permitiram até ao momento avaliar se esta intervenção tem efeitos semelhantes em seres humanos, contudo resultados preliminares indicam que alguns factores de risco para doenças são reduzidos em pessoas sujeitas à CR. Os mecanismos através dos quais a CR actua são ainda controversos, mas os estudos realizados até ao momento permitem discernir algumas das vias metabólicas que provavelmente mediam este processo. A evidência sugere que a via do alvo da Rapamicina (TOR), um sensor de nutrientes, está relacionada com a CR em vários modelos biológicos, tais como levedura, C. elegans e Drosophila. A inibição do TOR provoca um aumento da longevidade e visto que este acréscimo não pode ser ampliado pela CR, é provável que a via TOR seja uma das mediadoras desta intervenção. Esta via metabólica encontra-se relacionada com o desenvolvimento e o crescimento, mas é possível que em adultos, uma vez que o processo de desenvolvimento já terminou e portanto ocorre muito pouco crescimento, a activação do TOR possa desencadear o envelhecimento, fazendo sentido que a CR inactivasse este processo. Outra via metabólica que se encontra também relacionada com a CR é a via de sinalização da insulina/IGF-1 (IIS). Estudos realizados demonstram claramente que a inibição desta via tem um efeito de aumento da longevidade, tanto em invertebrados, tais como C. elegans e Drosophila, como em ratinhos, através da activação de um factor de transcrição (FOXO) mais abaixo na cascata de sinal. Contudo, a relação entre esta via e a CR não é clara. Se por um lado a resposta à CR é diminuída quando o FOXO é inactivado, ela não é contudo eliminada completamente. Estes resultados sugerem que há apenas uma sobreposição parcial entre os dois processos. Dado que a CR é um regime difícil de manter por seres humanos, para melhor tirar partido dos seus benefícios seria importante descobrir fármacos que possam actuar pelo mesmo mecanismo que a CR, induzindo efeitos benéficos semelhantes, chamados de miméticos da CR (CRM). Apesar de existirem já alguns fármacos que poderão ser CRMs, seria de interesse ter algum método que permitisse obter uma série de candidatos para testar. Os objectivos deste trabalho são descobrir fármacos capazes de provocar efeitos semelhantes à CR e validar um método bioinformático para obter candidatos a CRM. Este método baseia-se numa ferramenta, o Connectivity Map (Cmap), que usa perfis de expressão génica para gerar uma lista de moléculas com actividade biológica cujo efeito no organismo correlaciona-se com um estado biológico de interesse, neste caso a resposta à CR. Após aplicação deste método, escolheram-se os fármacos mais promissores para teste dos obtidos pelo Cmap: Geldanamicina, 15d-PGJ2, Rapamicina, Radicicol, LY-294002, 17-AAG, Tricostatina A (TSA), Fulvestrant, Ácido nordihidroguaiarético e Alantoína. Os fármacos escolhidos foram testados em C. elegans, um importante modelo biológico. Este animal foi utilizado em grande parte pelo seu curto tempo médio de vida, o que é bastante útil em experiências pela longevidade. Além da estirpe wild-type N2, recorreu-se também a uma estirpe mutante eat-2, com defeitos na faringe que limitam o consumo de comida, simulando um estado de CR. Inicialmente, foi necessário optimizar as concentrações destes fármacos que permitam obter o efeito mais potente possível sem toxicidade para os animais. Verificou-se que vários destes fármacos podem ser letais em concentrações mais elevadas. Após escolha das dosagens óptimas, selecionou-se apenas quatro dos fármacos em estudo para realizar os testes de longevidade. A opção recaiu sobre a Rapamicina, o LY-294002, a TSA e a Geldanamicina. Avaliou-se a sobrevivência das duas estirpes de C. elegans, simulando duas dietas diferentes ad libitum (AD) e CR, tanto com como sem adição destes quatro fármacos. Assim é possível não só determinar o seu efeito na longevidade destes animais como obter uma indicação da relação entre o seu mecanismo e o da CR. A Rapamicina e o LY-294002 induziram ambas um aumento de 19.2% na sobrevivência mediana da estirpe N2, contudo não alteraram significativamente a sobrevivências dos mutantes eat-2. Estes resultados eram já algo esperados, uma vez que se sabia que a Rapamicina é capaz de estender a longevidade em Drosophila e ratinho; e o LY-294002 aumenta a sobrevivência em C. elegans. Mais importante é o facto de estes fármacos não terem o mesmo efeito nos animais sob CR, possivelmente porque as vias activadas por eles já se encontram activas nestes mutantes – uma indicação de que a Rapamicina e o LY-294002 são talvez CRMs. Esta hipótese já tinha sido avançada, uma vez que o alvo molecular da Rapamicina é o TOR e o do LY-294002 é o PI-3K (parte da via IIS), ambos parte de vias que se pensa mediarem pelo menos parcialmente a resposta à CR. Similarmente, a TSA aumenta a sobrevivência mediana dos N2 em 11.5%, mas não a da estirpe eat-2. Já tinha sido demonstrado que este fármaco provoca um aumento da longevidade em Drosophila, tornando o resultado em N2 esperado, contudo não existia até ao momento nenhum indício de que a acção deste fármaco estava relacionada com a CR. Após este resultado, pode-se propor que a TSA é possivelmente um CRM. Já a Geldanamicina não teve qualquer efeito na sobrevivência da estirpe N2, mas diminuiu em 26.9% a sobrevivência mediana da estirpe eat-2, cancelando o efeito de aumento de longevidade da CR. Apesar de saber-se que a Geldanamicina tem um efeito de indução da senescência em alguns tipos de células, não tinha sido testado qual o seu efeito na longevidade. Com estes resultados, põe-se a hipótese de que a Geldanamicina, não afectando a longevidade em condições normais, impede esta se altere em resposta à CR. É possível que tal aconteça porque este fármaco actua através das mesmas vias metabólicas que a CR, mas estimulando-as a funcionarem de maneira oposta. No entanto, em qualquer destes quatro fármacos verifica-se uma discordância com o efeito previsto para eles no Cmap. Nomeadamente, a previsão para a Geldanamicina é que tivesse um efeito semelhante ao CR, enquanto que a Rapamicina, o LY-294002 e a TSA teriam o efeito oposto. Não só isto não se verificou experimentalmente, como parece contradizer a literatura existente. Analisou-se os genes mais significativos para as previsões do Cmap, com o objectivo de tentar compreender a razão por que as previsões obtidas são simetricamente opostas ao observado e quais as vias e metabolitos mais afectados por estes fármacos e pela CR. Tanto numa análise mais geral, com todos os fármacos com resultados mais significativos, como noutra mais específica usando apenas os quatro fármacos testados, os resultados foram semelhantes. A inconsistência em relação às previsões do Cmap não ficou completamente esclarecida, contudo esta análise apoia os resultados obtidos experimentalmente. Obteve-se ainda uma lista de genes que poderão estar envolvidos na resposta à CR, assim como no mecanismo de acção destes fármacos, o que é útil para trabalhos futuros. Muitos destes genes encontram-se envolvidos em processos de resposta ao stress, no ciclo celular ou na regulação do crescimento e proliferação celular. Este trabalho demonstra então que a abordagem para obtenção de candidatos a CRM usando o Cmap pode ser útil, pois os candidatos obtidos parecem estar de facto relacionados com a CR. No entanto, não é claro que a acção prevista corresponda necessariamente aos resultados experimentais. Adicionalmente, os resultados obtidos indicam que a Rapamicina, o LY-294002 e a TSA poderão ser talvez CRMs, enquanto que a Geldanamicina é capaz de cancelar os efeitos da CR, usando possivelmente as mesmas vias metabólicas.This work assesses a new bioinformatic tool, the Connectivity Map (Cmap), in predicting Calorie Restriction Mimetic (CRM) candidates. The Cmap used gene-expression profiles to predict that the following drugs act through a mechanism strongly correlated to that of Calorie Restriction (CR): Geldanamycin, 15d-PGJ2, Rapamycin, Radicicol, LY-294002, 17-AAG, Trichostatin A (TSA), Fulvestrant, Nordihydroguaiaretic acid and Allantoin. These drugs were tested in the nematode worm Caenorhabditis elegans (C. elegans), to optimize concentrations so as to get the strongest effect without poisoning the animals. Then the four most promising drugs were chosen for further testing: Geldanamycin, Rapamycin, LY- 294002 and TSA. Lifespan assays with these drugs were performed in both wild-type (N2) and eat-2 strains. The latter induces a CR-like state by limiting nutrient intake. Rapamycin, LY-294002 and TSA increased median survival in N2 animals by 19.2%, 19.2% and 11.5%, respectively; but not in eat-2. This is an indicator that the lifespan extension induced by them may function through the same mechanisms as CR. While the Cmap predicted these drugs would have the opposite effect of CR, they were known from the literature to increase longevity. LY-294002 and Rapamycin were even suspected of being CRM, given that their known targets are part of CR-related pathways. Therefore, these results are consistent with previous studies. Geldanamycin had no effect on N2, but decreased survival of eat-2 mutants by 26.9%, indicating that it might act through the same mechanisms as CR, but with an opposite effect, cancelling the CR-induced lifespan extension. This result was not expected from the Cmap results that predicted Geldanamycin to mimic CR. Analysis of the most significant genes for the Cmap results was not able to explain the discrepancies, but corroborated the experimental data and indicated some genes, such as HSPA8 and MDM2, possibly involved in the CR and drugs’ mechanisms