Propagation of Cyclamen mirabile Hildebr. (Primulaceae) by using tissue culture techniques

Bu çalışmada endemik bir bitki olan Cyclamen mirabile Hildebr. türünün in vitro doku kültürü teknikleri ile çoğaltımı sırasında aşılması gereken süreçler araştırılmıştır. Eksplant olarak, tohumların in vitro çimlendirilmesi ile elde edilen steril fideler ve olgun bitki kısımları kullamlmıştır. Tohumlar ve doğal ortamından toplanan olgun bitki kısımları için öncelikle en uygun sterilizasyon serileri belirlenmiştir. Tohum sterilizasyonunda en uygun yöntemin, % 70'lik etil alkol ile 10 dk. ve ardışık olarak % 4.5Tik sodyum hipoklorit (+ 2 damla Tween-80) ile 25 dk. muamele etmek olduğu tespit edilmiştir. Yaprak ayası, yaprak sapı ve çiçek sapı eksplantlannm sterilizasyonu için % 70'lik etil alkolde 30 sn, ardışık olarak % 4.5'lik NaOCİ ( + 2 damla Tween 80) 'de 7 dk bekletmenin en uygun yöntem olduğu görülmüştür. Etiole edilmiş yaprak saplarının sterilizasyonu için ise 5 dakikalık NaOCİ uygulamasının yeterli olduğu tespit edilmiştir. Tuber (kabuğu soyulmuş) ve kök eksplantlannm sterilizasyonu için en uygun yöntemin % 70Tik etil alkol ile 5 dk. ve ardışık olarak % 4.5'lik sodyum hipoklorit (+ 2 damla Tween-80) ile 15 dk muamele etmek olduğu belirlenmiştir. Meyva sterilizasyonu için en uygun yöntemin, % 70'lik etil alkol ile 5 dk. ve % 4.5'lik sodyum hipoklorit (+2 damla Tween-80) ile 20 dk muamele etmek olduğu tespit edilmiştir. Steril edilen tohumlar ve olgun bitki kısımları farklı tip ve konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri içeren çeşitli ortamlara aktarılarak, in vitro doku kültürü tekniklerine vereceği cevaplar araştırılmıştır. C. mirabile 'nin tohumlarının çimlenmesi için Vı MS ortamının en uygun ortam olduğu gözlenmiştir. Bu ortamda 8. hafta sonunda maksimum çimlenme yüzdesi yaklaşık % 53 olarak belirlenmiştir. Steril fidelerden alınan yaprak sapı eksplantlanmn kullanıldığı denemelerde sadece, 22 ± 1 °C'de karanlıkta 8 hafta süre ile 2 mg/1 NAA içeren î4 MS ortamına kültüre edilen eksplantlardan kalkışlar elde edilmiştir. Inkübasyondan 5 hafta sonra oluşmaya başlayan kallusların oluşum oram % 25'dir. Ancak oluşan kalkışların, yaklaşık 5 hafta sonra karararak gelişimlerinin durdukları gözlenmiştir. Steril fidelerden alman ve pasta dilimi şeklinde 4 çeyreğe ayrılarak organogenezis ve somatik embriyogenezis için farklı ortamlara aktarılan tuber -78 eksplantlanndan, 0.1 mg/1 IAA + 0.5 mg/1 Kin ve 0.5 mg/1 NAA + 0.5 mg/1 Kin içeren BN ortamlannda tek sürgünler elde edilmiştir. Sürgün oluşturan tuber eksplantlarının oranı % 12.5'dir. Sürgün çoğaltanını teşvik etmek için steril fidelerden elde edilen tuberler, kesim ile meydana gelebilecek risklerden kaçınmak için parçalanmadan, tam olarak ve apikal sürgünleri uzaklaştırılarak çeşitli ortamlara aktarılmıştır. Temel ortam olarak Vz MS ortamının kullanıldığı denemelerde 1 mg/1 BA içeren ortama aktarılan tuberler için eksplant basma düşen ortalama sürgün sayısı 9.6'dır (sürgün/eksplant). BA miktarının artması eksplant basma düşen sürgün sayısında bir azalmaya sebep olmuştur. BA'mn NAA ile birlikte kullanıldığı durumlarda, NAA'nın eksplant basma sürgün sayışım arttırdığı gözlenmiştir. En yüksek sürgün sayısı (12.2 sürgün/eksplant) 1 mg/1 BA + 0.1 mg/1 NAA içeren ortamda elde edilmiştir. Artan B A miktarına karşın sürgün sayısının azaldığı görülmüştür. Sürgün çoğaltanının teşvik edildiği ortamlarda mikrotuber benzeri yapılar da oluşmuştur. BA'mn tek basma kullanıldığı durumlarda, mikrotuber benzeri yapıların en yüksek oranda 2 mg/1 BA içeren ortamda olduğu gözlenmiştir (5.2 mikrotuber/ tuber). 2 mg/1 BA'mn altındaki ve üstündeki konsantrasyonlarda, eksplant başına düşen mikrotuber sayısmda bir azalma görülmüştür. Mikrotuber benzeri yapıların oluşumu, ortamlara NAA ilavesi ile artış göstermiştir. Eksplant basma ortalama en yüksek mikrotuber sayısı 2 mg/1 BA ve 0.1 mg/1 NAA içeren ortamlarda elde edilmiştir (6 mikrotuber / tuber). Ayrıca Vz MS ortamında çimlenen tohumlardan oluşan bazı fidelerin köklerinin uç kısmında mikrotuberlere benzeyen kahverengi dairesel yapılar gelişmiştir. Olgun bitkilerden alınan yaprak sapı eksplantlanndan sadece, 22 ± 1 °C'de karanlıkta 8 hafta süre ile 2.2 mg/1 TDZ + 0.1 mg/1 NAA içeren V2 MS ortamında kültüre edilenlerde kalluslar elde edilmiştir. İnkübasyondan 4 hafta sonra oluşmaya başlayan kalkışların oluşum oram % 25'dir. Elde edilen kalluslar 4 hafta sonra alt kültür edilmiş fakat alt kültür edildikten 2 hafta sonra karararak ölmüşlerdir. Somatik embriyogenezis, ve organogenezis için farklı tip ve konsantrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri içeren çeşitli ortamlara aktarılan -79- olgun yaprak ayası, tuber, kök ve övül eksplantlanndan hiçbir sonuç alınamamış ve eksplantlann ortama aktarıldıktan 1-2 gün sonra kahverengileştiği ve öldüğü gözlenmiştir. Olgun bitki kısımlarının kullanıldığı denemelerde kahverengileşmenin fenolik bileşiklerin oksidasyonuna bağlı olarak gerçekleştiği düşünülmüştür. Ancak yaprak ayası, yaprak sapı ve tuberlerinin fenolik bileşikleri kalitatif yöntemlerle tespit edilememiş ve eksplantlar indikatör olarak kullanılabilecek düzeyde herhangi bir kahverengileşme göstermemiştir. Fenolik bileşiklerin tespiti için NaOH'e maruz bırakılan ovüller, bu bileşiğin farklı konsantrasyonlarında farklı derecelerde renk değişimi göstermişlerdir. Olası fenolik oksidasyon nedeniyle cevap alınamamış olgun bitki kısımları (yaprak ayası, yaprak sapı, çiçek sapı, tuber, kök ve övül eksplantlan) bu kez, fenolik bileşiklerin giderilerek oksidasyonun önlenmesi amacı ile ekim yapılmadan önce, askorbik asit, sitrat ve sistem' den hazırlanan antioksidant yıkama solüsyonu ile yıkandıktan sonra kültür ortamlarına aktarılmışlardır. Antioksidant yıkama solüsyonu ile yıkanarak ekimi yapılan eksplantlann, uzun bir süre kahverengileşmediği gözlenmiştir. Ayrıca ekim yapılacak kültür ortamlarına, tek başına sistein (40 mg/1), tek basma askorbik asit (20 mg/1) ve sistein + askorbik asit birlikte ilave edilmiş ve eksplantlar ayrıca bu ortamlara ekilmiştir. Her biri antioksidant özelliklere sahip olan bu bileşiklerin bulunduğu kültür ortamlarında da kahverengileşme uzun bir süre olmamıştır. Ancak bu eksplantlardan da herhangi bir morfogenetik cevap alınamamıştır. Etilenin in vitro morfogenezisde inhibe edici etkisi olduğundan dolayı, etilen biyosentezini inhibe etmek için asetil şahsilik asit kullamlmıştır. Eksplantlar, asetil şahsilik asit (20 ppm ve 40 ppm) içeren ortamlara kültüre edilmiş fakat yine bir sonuç elde edilememiştir.The procedures must be overcome during the stages of propagation of Cyclamen mirabile, an endemic plant by using in vitro tissue culture techniques had been investigated. Sterile seedlings from in vitro germinated seeds and mature plant parts (leaf lamina, petiole, pedicel, tuber, ovule and roots) were used as explants. Appropriate sterilization series were determined for seeds and plant parts which were collected from nature. Treatment with 4.5 % NaOCl plus two drops of Tween 80 for 25 minutes were found as the most appropriate methods for seed sterilization Sinking in 4.5 % NaOCl plus two dropes of Tween 80 for 7 minutes after sinking in ethanol (%70) for 30 sec. were evaluated as the most useful method for sterilization of explants from lamina, petiole and pedicels. In etioled petioles, treatment with NaOCl for 5 min. was found as sufficient for sterilization. In sterilization of tubers (decorticated) and root explants, treatment with 4.5 % NaOCl plus two drops for 15 min. following 70 % ethanol for 5 minutes was determined as the most appropriate method. The most useful method for sterilization of fruits was to treat them with 70 % ethanol for 5 min and 4.5 % NaOCl plus two drops of Tween 80 for 20 min. Sterilized seed and mature plant parts were transferred to media containing plant growth regulators in different types and concentrations to observe then- responses to in vitro tissue culture techniques. XA MS was found as the most useful medium to germinate seeds of C. mirabile. In this medium maximum germination was 53 % at the end of 1 0 week. In the experiments which used petiole explants from sterilized seeds, calli were obtained from only explants which were cultured in V2 MS medium containing 2 mg/1 NAA under 22 ± 1 °C temperature for 8 weeks in dark. Five weeks after incubation, rate of calli formation was 25 % but these calli were brownish and their growth was inhibited after 5 weeks. Soliter shoots were obtained in BN media containing 0.1 mg/1 IAA plus 0.5 mg/1 Kin and 0.5 mg/1 NAA plus 0.5 mg/1 Kin from tuber explants of sterilized seedlings were sliced into 4 equal parts which all were transferred to different media to observe organogenesis and somatic embryogenesis. -81 To promote shoot proliferation, tubers from sterile shoots were transferred to different media without slicing to avoid possible risks of slicing. In the experiment that Vz MS was basal medium, averaged shoot number was 9.6 per explant for tubers, transferred to medium containing 1 mg/1 BA (shoot/explant). Increased BA concentration caused a decrease in shoot number per explant. It is observed that NAA increased shoot number per explant when it is used with BA. The highest number of shoots (12.2 shoot/explant) was obtained in medium containing 1 mg/1 BA + 0. 1 mg/1 NAA. Increasing amount of BA decreased shoot number per explant. Tuber-like structures were formed in the media which promoting shoot proliferation. In the cases which BA were used solely, microtuber-like structures were formed in the highest rate in medium containing 2 mg/1 BA (5.2 microtuber/tuber). At lower and higher consentration of BA, microtuber formation per explant were decreased. Formation of microtuber like structures were increased by adding NAA to the media. The highest number of microtuber per explant was obtained in the medium containing 2 mg/1 BA and 0.1 mg/1 NAA (6 microtuber/tuber). Additionally, microtuber-like brownish, circular structures were observed in the medium containing Vz MS. Only callus formation obtained in petiole explants from mature plants when they were cultured in medium Vz MS containing 2.2 mg/1 TDZ + 0.1 mg/1 NAA for 8 weeks under 22 ± 1 °C temperature. Callus formation rate was 25 % after 4 weeks of incubation. These calli were subcultured after 4 weeks and became brownish and then died after 2 weeks of subculturing. There was no result from explants of lamina, tuber, pedicel, root and ovule which were transferred to media containing different types and concentrations of plant growth regulators for somatic embryogenesis and organogenesis. All these explants became brownish and then died after 1-2 days. In the experiment which mature plant parts were used, it was thought that brownish color was an event depending upon oxidation of free radicals. Unfortunately, phenolic compounds of lamina, petiole, pedicel and tubers could not determinated by qualitative methods and no explants showed brownish color which could be used as indicator. Ovules exposured NaOH treatment to detect phenolic 82- compound showed different colour changes depending on transferring to different concentrations of NaOH. Mature plant parts (lamina, petiol, pedicel, tuber, root and ovule) having no response probably as a result of phenolic oxidation were washed with an antioxidant containing ascorbic acid, citrate and cystein before transferring to prevent the oxidasyon by removing phenolic compounds and then they were transferred to culture media. It is observed that these explants which were washed with antioxidant solution protected their orginal colour without brownish dying for a long time. Additionally, cysteine, ascorbic acid and cysteine + ascorbic acid were added to media and some of explants were cultured in these media. Brown colour formation were not observed during relatively long time in the media containing these antioxidant compounds but no morphogenetic response from these explants in the media were obtained. Acetyl salycilic acid were used to block ethylene biosynthesis because of inhibitory effect of ethylene in vitro morphogenesis. Additional explants were also cultured in media containing acetyl salycilic acid but no response had been obtained