Ferritiini fuusioproteiinien in vivo itsejärjestymismekanismit

Ferritins are spherical iron storage proteins and widely studied protein building blocks for many biomaterial applications. These protein particles are known to assemble into two-dimensional sheets into hexagonal plane. However, a ferritin fusion protein GFP-resilin-ferritin produced at VTT Ltd formed unprecedented spear-like supramolecularly self-assembled structures. The aim of this thesis was to gain molecular level insights into its self-assembly mechanisms. In this thesis, five fusion protein constructs were produced and their in vivo supramolecular assemblies were examined. Trichoderma reesei strain producing GFP-resilin-ferritin was cultivated and visualized with confocal microscopy for studying in vivo self-assembly mechanisms. Purification procedures including sonication and homogenization by mixer mill were attempted. New constructs expressing ferritin and HFBI-ferritin were designed, cloned and agroinfiltrated to Nicotiana benthamiana tobacco plants. Also, resilin fusion proteins ZERA-resilin and GFP-resilin-HFBI were expressed N. benthamiana. These four fusion proteins were purified from ground leaves by sucrose gradient ultracentrifugation. The in vivo self-assembly mechanisms of the fusion proteins were studied by confocal microscopy, whereas purified fusion proteins were investigated also by conventional and cryogenic transmission electron microscopy (Cryo-TEM) imaging. The new ferritin construct self-assembled into long thin spears similar to those of GFP-resilin-ferritin, thus indicating that ferritin would drive the spear-like self-assembly. Resilin fusion proteins ZERA-resilin and GFP-resilin-HFBI formed only spherical PBs, so it is suggested that resilin does not have an impact to spear-like assembly of GFP-resilin-ferritin. HFBI-ferritin formed spherical PB-like structures, which is likely due to PB-inducing fusion protein partner HFBI. Purified ferritin fusion proteins did not show similar self-assembled structures when observed with TEM. These observations provide insights for recombinant protein self-assembly research.Ferritiinit ovat raudan varastoproteiineja ja laajalti tutkittuja proteiinirakennuspaloja useita biomateriaalisovelluksia varten. Näiden proteiinipartikkelien tiedetään järjestyvän kaksiulotteisiksi kerroksiksi kuusisivuiseen tasoon. VTT Ltd:llä tuotetun ferritiini fuusioproteiinin GFP-resiliini-ferritiinin havaittiin kuitenkin muodostavan ennennäkemättömiä supramolekulaarisesti itsejärjestyneitä tikkumaisia rakenteita. Tämän diplomityön tavoitteena oli saada syvempi molekyylitason käsitys tämän fuusioproteiinin itsejärjestymismekanismeista. Tässä työssä tuotettiin viisi fuusioproteiinikonstruktia ja niiden in vivo supramolekulaarisia järjestymisiä tutkittiin. In vivo itsejärjestymismekanismien tutkimista varten GFP-resiliini-ferritiiniä tuotettiin Trichoderma reesei sienessä ja tutkittiin konfokaalimikroskoopilla. Fuusioproteiinien puhdistusta yritettiin sonikaatiolla ja homogenoimalla niitä sekoitusmyllyssä. Uudet konstruktit, ferritiini ja HFBI-ferritiini, kloonattiin ja agroinfiltroitiin Nicotiana benthamiana tupakkakasveihin. Resiliini fuusioproteiinit ZERA-resiliini ja GFP-resiliini-HFBI tuotettiin N. benthamianassa. Nämä fuusioproteiinit puhdistettiin jauhetuista tupakan lehdistä sakkaroosigradientti ultrasentrifugaatiolla. Näiden in vivo itsejärjestymismekanismeja tutkittiin konfokaalimikroskoopilla, kun taas puhdistettuja fuusioproteiineja tutkittiin myös konventionaalisella ja kryogeenisellä läpivalaisuelektronimikroskoopeilla. Uusi ferritiini konstrukti itsejärjestyi samankaltaisiksi pitkiksi ja ohuiksi tikuiksi kuin GFP-resiliini-ferritiinin tapauksessa havaittiin. Tämä osoittaa, että ferritiini voisi olla ajava tekijä tässä itsejärjestymisessä. Resiliini fuusioproteiinit ZERA-resiliini ja GFP-resiliini-HFBI itsejärjestyivät pallomaisiksi proteiinijyväsiksi, joten voidaan todeta, että resiliinillä ei ole vaikutusta GFP-resiliini-ferritiinin tikkumaiseen rakenteeseen. HFBI-ferritiini muodosti pallomaisia proteiinijyväsrakenteita, minkä oletetaan johtuvan proteiinijyväseksi indusoivasta HFBI fuusioproteiinipartnerista. Puhdistetut ferritiini fuusioproteiinit eivät itsejärjestyneet samalla tavalla, kun niitä tutkittiin läpivalaisuelektronimikroskoopilla. Nämä havainnot tarjoavat syvemmän käsityksen rekombinanttiproteiinien itsejärjestymismekanismeihin