Investigation of isolated compounds from spider caranguejeira Acanthoscurria natalensis Chamberlin, 1917 and its chemical and biological characterization

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018.Texto parcialmente liberado. Conteúdo restrito: Parte II e III.A peçonha de aranhas é composta por uma mistura complexa de moléculas, como acilpoliaminas, peptídios e proteínas neurotóxicas e, enzimas, como hialuronidases. A caracterização destas moléculas tem possibilitado o desenvolvimento de diversas aplicações farmacológicas e biotecnológicas. Contudo, poucas moléculas foram estudadas em aranhas do gênero Acanthoscurria, inclusive em Acanthoscurria natalensis. Assim, o objetivo deste estudo foi a investigação de compostos presentes na peçonha de A. natalensis e sua caracterização química e biológica. A peçonha foi fracionada por cromatografia líquida (RP-HPLC) obtendo-se 18 frações principais. O screening de atividades biológicas da peçonha e/ou frações, identificou ação antimicrobiana pronunciada, manutenção da viabilidade celular e redução da produção de óxido nítrico, na fração composta por acilpoliaminas. A peçonha apresentou atividade hialuronidásica correspondente a fração 18 (AnHyal) e nenhuma atividade proteásica e fosfolipásica. A concentração inibitória mínima (CIM) das acilpoliaminas contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli variou entre 128 e 256 μM, sem causar hemólise nestas mesmas concentrações. A estrutura química parcial das acilpoliaminas (614―756 Da) sugerida pelo espectro UV e padrão de fragmentação (ESI-MS/MS), compreende uma unidade tirosil ligada a uma cadeia poliamina, contendo ao menos uma espermidina. A caracterização da AnHyal indicou atividade máxima entre pH 4,0 e 6,0 e temperatura entre 30 e 60oC, degradando preferencialmente o ácido hialurônico. O sequenciamento parcial (LC-MS/MS e degradação de Edman) da AnHyal mostrou similaridades para a hialuronidase da aranha Brachipelma vagans e proteína CRISP de Grammostola rosea, com 64% e 79% de cobertura proteica, respectivamente. Análises por 1D e 2D BN-PAGE/SDS-PAGE/zimograma, mostraram que a AnHyal é composta pelas proteínas hialuronidade e CRISP, formando um complexo enzimaticamente ativo. Sua estrutura secundária contém 36,15% de α-hélice e a temperatura de desnaturação (Tm) foi de 46,37 °C, sendo esta irreversível. Em conclusão, este estudo possibilitou a identificação e caracterização parcial de acilpoliaminas com propriedades biológicas que podem contribuir para sua qualificação como possível agente terapêutico. Ainda, a AnHyal mostrou a presença de um complexo proteico enzimaticamente ativo entre as proteínas hialuronidase e CRISP, sendo este descrito pela primeira vez. Estudos adicionais poderão elucidar outras propriedades deste complexo, ampliando as possibilidades de aplicações biotecnológicas.Spider venom is composed of a complex mixture of molecules, such as acylpolyamines, peptides and neurotoxic proteins, and enzymes such as hyaluronidases. The characterization of these molecules has enabled the development of several pharmacological and biotechnological applications. However, few molecules have been studied in spiders of the genus Acanthoscurria, including Acanthoscurria natalensis. Thus, the objective of this study was the investigation of the compounds present in A. natalensis venom and its chemical and biological characterization. The venom was fractionated by liquid chromatography (RP-HPLC) obtaining 18 main fractions. The screening of biological activities of venom and/or fractions, identified pronounced antimicrobial action, maintenance of cellular viability and reduction of nitric oxide production, in the fraction composed of acylpolyamines. The venom presented hyaluronidase activity corresponding to fraction 18 (AnHyal) and no protease and phospholipase activity. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the acylpolyamines against Staphylococcus aureus and Escherichia coli varied between 128 and 256 μM, without causing hemolysis at these same concentrations. The partial chemical structure of the acylpolyamine (614-756 Da) suggested by the UV spectrum and fragmentation standard (ESI-MS / MS) comprises a tyrosyl moiety attached to a polyamine chain containing at least one spermidine. The characterization of AnHyal indicated maximum activity between pH 4.0 and 6.0 and temperature between 30 and 60oC, preferentially degrading hyaluronic acid. AnHyal's partial sequencing (LC-MS / MS and degradation of Edman) showed similarities to the Brachipelma vagans spider hyaluronidase and Grammostola rosea CRISP protein, with 64% and 79% protein coverage, respectively. Analyzes by 1D and 2D BN-PAGE/SDS-PAGE/zymogram, showed that AnHyal is composed of hyaluron and CRISP proteins, forming an enzymatically active complex. Its secondary structure contains 36.15% α-helix and the denaturation temperature (Tm) was 46.37 ° C, which is irreversible. In conclusion, this study allowed the identification and partial characterization of acylpolyamines with biological properties that may contribute to its qualification as a possible therapeutic agent. Furthermore, AnHyal showed the presence of an enzymatically active protein complex between the hyaluronidase and CRISP proteins, which is described for the first time. Further studies may elucidate other properties of this complex, expanding the possibilities of biotechnological applications