Estudis estructurals i enzimàtics de la Uroporfirinogen III Sintasa humana. Bases moleculars de la Porfíria Eritropoiètica Congènita.

[cat] El grup prostètic hemo és un component essencial de moltes proteïnes, com l'hemoglobina, la mioglobina i els citocroms. Existeixen quatre reaccions concatenades en la síntesi del grup hemo que són comunes en els diferents regnes animal, vegetal, i bacterià. Dues d'aquestes reaccions estan catalitzades per l'enzim Porfobilinogen Desaminasa (PBGD) i l'enzim Uroporfirinogen III Sintasa (U3S). Alteracions en l'activitat enzimàtica de la U3S donen lloc a una malaltia, la Porfíria Eritropoiètica Congènita (PEC). En les últimes dècades s'han incrementat els anàlisis genètica a pacients, facilitant una gran quantitat d'informació que relaciona aquesta malaltia amb alteracions en la seqüència d'aminoàcids de l'enzim U3S. Per determinar l'activitat enzimàtica dels enzims mutants relacionats amb la patologia s'han clonat, expressat i purificat les 25 mutacions puntuals patogèniques trobades en pacients, així com les proteïnes U3S salvatge i PBGD (necessària per dur a terme l'assaig enzimàtic). Els resultats de l'activitat relativa d'aquests enzims mutants poden explicar un seguit de fenotips, però no la seva totalitat. De fet, l'anàlisi dels resultats de l'activitat enzimàtica ha revelat que la gran majoria de les mutacions retenen una gran quantitat de l'activitat catalítica de la forma salvatge. Per entendre l'efecte d'algunes mutacions, s'ha realitzat un detallat estudi estructural i termodinàmic d'aquestes proteïnes. Amb aquest objectiu, s'ha determinat l'estabilitat cinètica d'aquestes proteïnes mutants respecte a la proteïna salvatge, i s'ha observat que en alguns casos, la mutació afecta l'estabilitat de l'enzim. Aquests estudis han permès identificar una regió helicoïdal de la proteïna imprescindible per al manteniment de l'estructura nativa. Per altra banda, s'havia descrit que la mutació C73R es trobava present en més d'un terç dels pacients de PEC, sent una mutació associada als fenotips més greus. Amb la col·laboració del Dr. Juan Manuel Falcón i el seu equip, i amb l'objectiu d'entendre l'efecte d'aquesta mutació en els sistemes vius, s'han realitzat una sèrie d'experiments in vivo que han permès determinar l'estabilitat relativa de la mutació C73R en l'entorn cel·lular, essent aquesta molt inferior respecte a l'enzim salvatge i mostrant un patró de degradació intracel·lular prematur. Nombrosos estudis han posat de manifest la possibilitat de manipular el plegament proteic dins de la cèl·lula mitjançant la utilització de "xaperones químiques". S'ha vist que l'ús d'aquests compostos pot aplicar-se en varies malalties associades amb pèrdues de la funció degudes a mutacions desestabilitzants. Estudis preliminars amb "xaperones químiques" han permès retenir la proteïna mutant C73R intracel·lular evitant-ne la degradació, obrint així, una nova línia d'investigació terapèutica.[eng] The term porphyria describes a family of autosomal diseases produced by the existence of one or more mutations in any of the enzymes in the heme group biosynthetic pathway. In particular, a deficient Uroporphyrinogen III Synthase (U3S) activity is ultimately responsible for the human Congenital Erythropoietic Porphyria (CEP). The severity of the disease is usually related to the residual enzyme activity. In an effort to better understand the relationship between U3S malfunction and CEP, we set out to obtain a detailed characterization of the 25 pathogenic missense mutations of U3S. Comparing the enzymatic activity results, we demonstrate that in some cases, enzyme activity is not the only explanation for the severity of the disease. Our hypothesis is that mutants can also alter protein unfolding thermodynamics, so stability properties of U3S have been investigated. We have demonstrated that protein unfold takes place so fast in a subset of mutations that retain most of the synthase activity, which explain their CEP phenotype. Furthermore, an important key helix for protein stability has been identified. Through collaboration with Dr. Juan Manuel Falcón, in vivo behaviour of the wild-type human U3S and the most frequently mutation found in CEP patients, C73R mutation, have been investigated. Preliminary results indicate that C73R mutant is expressed in some mammal cells, but its in vivo stability is lower than in case of the wild-type. Our recent experiments with chemical chaperones have increased C73R mutant in vivo stability, suggesting a new potential therapeutic treatment