Detection and characterization of emerging viral pathogens of general interest in food safety

[spa] El principal objetivo de esta tesis doctoral consiste en el estudio de virus patógenos emergentes de interés en seguridad alimentaria, mediante la evaluación de su prevalencia y diseminación ambiental, y la caracterización del riesgo asociado a la presencia de virus patógenos en la reutilización de agua residual y en el consumo de moluscos bivalvos. Para ello se ha estudiado la presencia del virus de la hepatitis E (HEV), hepatitis A (HAV), norovirus (NoV), nuevos poliomavirus (KIPyV, WUPyV y MCPyV) y adenovirus humanos (HAdV), como indicador de la contaminación fecal. Las muestras analizadas han sido agua residual cruda, agua regenerada, agua de río y moluscos bivalvos, caracterizando así las principales fuentes de contaminación fecal ambiental y alimentaria, y constatando el riesgo microbiológico asociado al consumo de marisco. Además, se ha tratado de mejorar la metodología disponible para la concentración de partículas víricas en agua residual, así como aportar información acerca de la eficiencia de eliminación de patógenos humanos a través de tratamientos de depuración en estaciones depuradoras de agua residual y en empresas productoras de marisco. Por último, se decidió profundizar en el ámbito de los análisis cuantitativos de riesgo microbiológico, estableciendo un modelo matemático para evaluar el riesgo de infección y enfermedad asociado al consumo de moluscos bivalvos contaminados por NoV. De esta manera, el trabajo se ha dividido en siete estudios comprendidos en cinco capítulos, obteniendo las conclusiones que se describen a continuación. La prevalencia de HEV en muestras de agua residual se ha establecido en un 30%, demostrando que HEV está circulando entre la población española y que el agua residual representa un foco de infección para este patógeno. Además, la presencia esporádica del genotipo 1 de HEV reafirma la hipótesis de la amplia distribución de los diferentes genotipos descritos. En cuanto al patrón de excreción de HAV, no se observan diferencias significativas al comparar las aguas residuales de dos áreas geográficas limítrofes dónde existen planes de vacunación distintos y niveles de saneamiento equivalentes, así se presume que la reducción drástica observada durante la última década no se debe exclusivamente a la aplicación de un programa de vacunación de amplia cobertura sino a la implementación de tratamientos de agua residual y estaciones depuradoras, así como a las mejoras en sanidad. Nuevos poliomavirus han sido detectados en agua residual, y MCPyV también en agua de río, indicando que pueden ser diseminados a través de contaminación por heces/orina de agua y potencialmente transmitidos por la ruta fecal-oral. Este trabajo representa la primera descripción de virus en agua residual y de río asociado con cáncer. Por otro lado, las estaciones depuradoras de agua residual estudiadas aquí reducen significativamente la presencia de indicadores de la contaminación fecal de elevada resistencia (HAdV, Cryptosporidium y Giardia). Tres nuevos métodos para concentrar partículas víricas en agua residual mediante diferentes aproximaciones técnicas (ultrafiltración, floculación orgánica y liofilización) se han desarrollado aquí. Así mismo, se ha reafirmando la presencia de patógenos víricos en muestras que cumplen las normativas europeas vigentes mediante la detección de NoV GGII y HAV en muestras de moluscos bivalvos de mercado y muestras vinculadas a un brote de hepatitis A, respectivamente. La eficiencia de tres tratamientos de depuración de moluscos bivalvos (UV, venturi y Ozono-UV), utilizando a HAdV como indicador de la contaminación fecal, esta limitada a la hora de reducir la presencia de partículas víricas. Además, se ha descrito una correlación significativa entre la identificación de muestras de moluscos bivalvos positivos para HAdV y para NoV GGII, mostrándose valores elevados de sensibilidad (100%) y especificidad (74%). Por ultimo, utilizando modelos de dosis-respuesta se ha modelizado matemáticamente el riesgo de infección y enfermedad por NoV asociado al consumo de ostras crudas. Los resultados muestran elevadas probabilidades de infección (8–54%) y enfermedad (1–36%) en función del número de ostras ingeridas (1–20).[eng] The main objectives of this thesis are the study of emerging viral pathogens of interest in food safety, by assessing their prevalence and environmental dissemination, and the characterization of the microbiological risk associated with the presence of pathogenic viruses in sewage reuse and consumption of bivalve molluscs. Thus, we studied the presence of hepatitis E virus (HEV), hepatitis A (HAV), norovirus (NoV), new polyomaviruses (KIPyV, WUPyV and MCPyV) and human adenovirus (HAdV) as an indicator of fecal contamination. The samples analyzed were raw sewage, reclaimed water (secondary and tertiary), river water and bivalve molluscs. Furthermore, it has sought to improve the methodology for concentration of viral particles from sewage, as well as provide information about the viral removal efficiency through sewage depuration treatments and shellfish production companies. Finally, a mathematical model has been established for a quantitative microbial risk assessment. Thus, the conclusions of these studies are described below. The HEV prevalence observed in sewage demonstrate that HEV is circulating among the Spanish population and that sewage is a source of infection. Moreover, the sporadic presence of HEV genotype 1 confirms the wide distribution of different genotypes. Regarding the pattern of HAV excretion, no significant differences emerged when comparing sewage from two adjacent areas with different vaccination programs and equivalent levels of sanitation; hence, it is presumed that the drastic reduction observed during lately is mainly due to improvements in healthcare. New polyomaviruses have been detected in sewage and river water, indicating their potential involvement in the fecal-oral route through contaminated water and representing the first description of cancer-associated virus in sewage and river. On the other hand, sewage treatment plants significantly reduce the presence of high-resistance fecal contamination indicators and three new methods to concentrate virus particles from sewage have been developed. Also, it has reaffirmed the presence of NoV GGII and HAV in samples that meet the European regulations through the detection of bivalve molluscs collected at market and samples linked to a hepatitis A outbreak, respectively. The efficiency of three treatments for bivalve molluscs depuration was found limited at reducing the presence of HAdV. In addition, a significant correlation between the identification of positive bivalve shellfish samples for HAdV and NoV GGII has been described, showing high sensitivity and specificity. Finally, using dose-response models we have mathematically modeled the risk of NoV infection and disease associated with raw oyster consumption