Desarrollo de una vacuna preventiva contra el VIH, basada en BCG recombinante

[spa] Construimos mediante ingeniería genética los diferentes vectores de expresión micobacteriano, a partir de los vectores parentales pMV261 y pMV361. Se desarrollaron 3 cepas BCG recombinantes expresando la proteína completa gp120 de la envuelta del VIH, cepa (HXBC2). Se evaluaron diferentes promotores de BCG para inducir la expresión de la proteína heteróloga del VIH. Inicialmente usamos el promotor hsp60 de BCG, un promotor fuerte que ha demostrado ser uno de los más eficaces y posteriormente, se probó con un promotor débil denominado alfa - antígeno. Una vez obtenidas las diferentes cepas BCG recombinantes se evaluó la expresión in vitro de la proteína mediante la técnica de Western blot. Posteriormente evaluamos in vivo la respuesta inmune celular específica, en un modelo animal murino. Se inmunizaron retones con las cepas BCGr: 222VIHA, BCGr: 223VIHA y virus vaccinia modificado cepa Ankara (VAM), expresando el inmunogeno del VIHA correspondiente a la proteína entera gag y envuelta del subtipo A predominante en África del este, más diferentes epítopos CTL de nef, pol. La respuesta específica de células T CD8+, se detectó por la tinción de los tetrámeros y por la tinción intracelular de IFN-alfa. Finalmente para superar las limitantes en la diferenciación de la inducción de citocinas entre BCG (cepa salvaje) y BCGr por la técnica de ELISPOT, evaluamos la expresión génica de IFN-alfa a partir de linfocitos de ratón, detectando el ARNm de esta citocina por la técnica de RT-PCR.Aportaciones de la tesis:- Diseño y desarrollo, por ingeniería genética y biología molecular de 3 cepas vacunales de BCG recombinante (BCGr:261VIH-1gp120, BCGr:222VIH-1gp120 y BCGr:223VIH-1gp120)- Estudio y descripción del reajuste genético que produce BCG cepa salvaje, cuando esta es transformada por el vector de expresión micobacteriano pMV261 que incluye clonado el fragmento de ADN que codífica la proteína del VIH-1 gp120 y que culmino con la deleción del mismo. (Este estudio se presento en un póster, en la Conferencia Mundial Sobre Vacunas VIH en Lausanne Suiza sept. 2004) - Los resultados de los ensayos preclínicos, para la evaluación de la inmunogenicidad de nuestras cepas vacunales, para inducir respuesta celular T CD8 específica frente al VIH-1 en ratones, evaluada por diferentes técnicas, proporcionan experiencias de utilidad en futuros ensayos referentes a las dosis, vías de administración y régimen empleado, así como en la selección de la técnica para detectar dicha respuesta inmune