Interacción funcional entre las proteínas implicadas en el reconocimiento molecular de adenosina

[spa] En las últimas décadas se ha puesto de manifiesto el importante papel regulador de algunos metabolitos que, además de intervenir en el metabolismo energético celular, poseen una función extracelular como autocoides al interaccionar con receptores específicos de la membrana, En este sentido, la adenosina y los nucleótidos derivados de la misma son un claro ejemplo de metabolitos capaces de ejercer una acción hormonal en la mayoría de tejidos. Esta tesis doctoral se enmarca dentro de este campo y pretende dar una visión de los sistemas responsables de la variación de la concentración de la adenosina extracelular, así como de los mecanismos que intervienen en su interacción con los receptores específicos. En el momento de iniciar este trabajo experimental, el grupo de investigación en el que se ha integrado esta tesis había demostrado la existencia de enzimas encargadas de producir y degradar adenosina en la membrana luminal de tubuladura renal de cerdo. Ello permitía predecir la aparición transitoria de este autocoide como producto del metabolismo nucleotídico extracelular. La adenosina generada en el medio extracelular puede ejercer sus efectos vía dos sistemas diferentes: uno es la acción directa sobre sus receptores específicos, mientras que el otro es su transporte hacia el interior celular. contribuyendo así a la recuperación de nucleósidos purínicos. Ambos aspectos constituían dos líneas de investigación de interés para nuestro equipo y por ello se propusieron como el objetivo fundamental de esta tesis doctoral. La consecución del objetivo global requería de estrategias bien diferenciadas. Para la caracterización molecular del transportador de nucleósidos, el cual interviene en la liberación y/o captación de la adenosina extracelular, la estrategia empleada ha sido la solubilización del transportador presente en vesículas de membrana de túbulo proximal de riñón de cerdo y la determinación de sus características mediante la unión de un inhibidor específico (nitrobenciltioinosina, NBTI) tritiado que, además, posee la capacidad de unirse covalentemente al transportador por acción de la luz ultravioleta de alta energía. El modelo de membranas renales aisladas, aunque óptimo para la caracterización de la unión de [delta/H]NBTI al transportador, es evidentemente limitado para otro tipo de estudios, como puede ser la regulación del transporte. Para llevar a cabo esta investigación se buscaron modelos más próximos a las condiciones "in vivo", que permitieran estudios de regulación por fosforilación del transportador. Se han empleado cultivos primarios de células epiteliales de riñón de cerdo, así como células LLC-PK 1, que son una línea epitelial derivada de túbulo proximal de riñón de cerdo. El segundo objetivo de esta tesis, fue la caracterización de los receptores que interaccionan con la adenosina, demostrando así su actividad como autocoide, Se han descrito cuatro subtipos de receptores de adenosina: A(l), A(2a), A(2b), A(3). Aunque casi todos ellos se expresan en distintas zonas del riñón, las BBM renales de cerdo y la línea celular LLC-PK presentan muy baja afinidad por cualquiera de los ligandos agonistas y antagonistas específicos de los distintos subtipos de receptores descritos, por lo que constituyen un sistema muy deficiente para estudiar receptores de adenosina desde el punto de vista farmacológico. La necesidad de emplear otras herramientas en la caracterización molecular de receptores impuso como objetivo primordial de esta tesis el desarrollo de anticuerpos que permitieran detectar la expresión de los receptores sin la necesidad de determinar la unión de radioligandos. En el momento que se planteó esta necesidad sólo se había clonado el receptor Al de adenosina, por lo que se abordó la obtención de anticuerpos antipeptídicos contra el receptor A(l) de adenosina. La obtención y caracterización de anticuerpos antipeptídicos contra el receptor A(l) ha constituido un reto importante ya que no se había logrado la obtención de anticuerpos antipeptídicos de ningún receptor de la familia de receptores acoplados a proteína-G. Ello ha motivado que la caracterización de los anticuerpos se haya realizado en sistemas modelo donde se conocía la expresión elevada de receptor A(l) funcional, como en corteza cerebral de cerdo y en la línea celular DDT(1)MF-2 de musculatura lisa de hamster. Durante el proceso de caracterización de los anticuerpos anti-AIR en estos sistemas, se han establecido tres hechos que consideramos de especial importancia. Uno es la existencia de una forma dimérica del receptor. Otro es que la ectoadenosina desaminasa (enzima que metaboliza adenosina en el medio extracelular) es capaz de interaccionar con el receptor A(l) (interacción proteína-proteína) y facilitar tanto la unión de ligandos como la transducción de la señal. En tercer lugar, hemos puesto de manifiesto que los receptores A(l) de adenosina, en el proceso de desensibilización por saturación con el agonista, sufren un proceso de agregación en la superficie celular que está mediado por un proceso de fosforilación en Ser/Thr del receptor. Los resultados presentados son, pues, una aportación al conocimiento global de la existencia y papel que desempeña la adenosina en el medio extracelular. Estos datos, aunque no sean directamente extrapolables a otros sistemas, pueden representar una gran ayuda en la interpretación de los efectos, muchas veces contradictorios, de la adenosina.[eng] The ubiquitous adenosine nucleoside, in addition to raking part in the cellular energetic metabolism, it has an extracellular hormonal function acting through specific receptors located on the cell surface. The adenosine generated in the extracellular medium is able to exert its actions via two different systems: one is acting through specific discrete membrane receptors located on the surface of cells, exerting multiple physiological actions in a variety of systems: while the other is the transport towards the inner part of the cell, thus, contributing to the recovery of purine nucleosides. The NBTI-sensitive nucleoside equilibrative transporter ("es" form) is a 65 kDa protein capable of showing different oligomeric associations. The transporter in LLC-PK 1 cells is regulated by a phosphorylation mechanism, probably by means of protein kinase A. The characterization of the receptors interacting with adenosine has been done by means of polyclonal anti-peptide antibodies which specifically recognize the A(l) adenosine receptor from different sources, showing three important racts: lhe existence of a dimeric form of the receptor; the capability of interaction of the ectoadenosine deaminase (enzyme that catabolizes adenosine in the extracellular medium), making easier whether the ligand binding or the signal transduction; and finally, it has been stared that A(l) adenosine receptors, during the desensitization process by agonist saturarion, undergo a clustering process on the cellular surface, which is the result of the receptor phosphorylation in Ser/Thr