Papel de las caveolas/caveolina-1 en la fisiologia del adipocito

[spa] La función de las caveolas y de la caveolina in vivo ha sido motivo de controversia, de hecho se han implicado en procesos de endocitosis y transcitosis, transporte de colesterol y ácidos grasos, regulación de procesos de transducción de señales y tumorigénesis (Liu et al., 2002). Sin embargo, la generación de los ratones KO de caveolina-1 (Drab et al., 2001; Razani et al., 2001a) mostraba que estos ratones eran perfectamente viables y fértiles, aunque estudios posteriores relacionaban a caveolina-1 con la homeostasis lipídica (Razani et al., 2002a). A partir de estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis ha sido: · Definir la función de las caveolas/ caveolina-1 en la fisiología del adipocito Nos planteamos así, nuestro primer objetivo: 1- Obtención de líneas 3T3L1 deficientes en caveolina-1 mediante silenciamiento génico posttranscripcional. 2- Analizar la presencia de caveolas y la distribución de la caveolina-1 remanente en las membranas de los adipocitos y estudiar la estructura y composición de los rafts lipídicos/caveolas en estos adipocitos deficientes en caveolina-1. 3- Analizar la diferenciación adipocitaria de los preadipocitos 3T3L1 deficientes en caveolina-1. 4- Analizar la acción de la insulina en los adipocitos deficientes en caveolina-1, 5- Estudiar el papel de caveolina-1 en el metabolismo lipídico del adipocito. A partir de los objetivos planteados conseguimor obtener las siguientes conclusiones en el desarrollo de esta tesis: 1. Se ha conseguido la transducción eficiente de adipocitos 3T3L1 maduros usando estas partículas lentivirales que expresan transgenes, aunque no se ha logrado transducir los adipocitos maduros eficazmente en el caso de los lentivirus que expresan moléculas de siRNA. 2. Los preadipocitos 3T3L1 son eficientemente transducidos usando las partículas lentivirales que permiten la expresión tanto de transgenes como de moléculas de siRNA. Mediante esta técnica hemos generado líneas estables 3T3L1 que expresan moléculas de siRNA de caveolina-1 y que presentan una reducción en la expresión de la proteína caveolina-1 de más del 93%. 3. La disminución de la proteína caveolina-1 en más de un 93% en adipocitos 3T3L1 provoca una disminución equivalente en el número de caveolas en la membrana plasmática. 4. La deficiencia en caveolina-1 en los adipocitos 3T3L1 no afecta a la localización de los marcadores proteicos y lipídicos característicos de los rafts lipídicos, que continúan recuperándose en las fracciones ligeras de los extractos celulares durante el aislamiento bioquímico de los rafts lipídicos. 5. La deficiencia en caveolina-1 y caveolas no afecta a la diferenciación de los preadipocitos 3T3L1 a adipocitos maduros, ni tampoco a las características morfológicas y el contenido lipídico (triacilglicéridos y colesterol) de los adipocitos maduros. 6. Los adipocitos 3T3L1 con una disminución del 93% en la expresión de caveolina-1, presentan una reducción del 50% en la expresión de las proteínas GLUT4 y del 40% en el caso del receptor de insulina, sin que este hecho responda a una menor cantidad de sus RNA mensajeros, sino a una disminución en la vida media de estas proteínas. Este dato sugiere que caveolina-1 participe en la estabilidad de estas proteínas. 7. El déficit de caveolina-1 en los adipocitos 3T3L1 no afecta a las vías de señalización de la insulina (dependiente de PI3K y dependiente de Cbl-TC10) ni tampoco a la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática inducida por la insulina ni a la estimulación del transporte de glucosa. 8. La presencia de caveolas/caveolina-1 no es necesaria para la correcta internalización de GLUT4 durante la reversión de la acción de la insulina. 9. Las caveolas/caveolina-1 tampoco son necesarias para la acción de la insulina inhibiendo o activando la lipólisis y la lipogénesis en los adipocitos 3T3L1, respectivamente. 10. La deficiencia de caveolina-1 y caveolas no altera el transporte de ácido palmítico a través de la membrana plasmática de adipocitos 3T3L1. Esta deficiencia tampoco altera la activación lipolítica por los efectores beta-adrenérgicos: Isoproterenol 10mu-M e IBMX 0,5mM en los adipocitos 3T3L1. PALABRAS CLAVE: Cavelonia-1, Caveola, Adipocito, Insulina, GLUT4, Receptor de insulina[eng] Caveolae are a specialized type of lipid rafts that are stabilized by oligomers of caveolin protein. Caveolae are particularly enriched in adipocytes. Here we analyzed the effects of caveolin-1 knockdown and caveolae ablation on adipocyte function. To this end, we obtained several multiclonal mouse 3T3-L1 cell lines with a reduced expression of caveolin-1 (95% reduction) by a small interfering RNA approach using lentiviral vectors. Control cell lines were obtained by lentiviral infection with lentiviral vectors encoding appropriate scrambled RNAs. Caveolin-1 knockdown adipocytes showed a drastic reduction in the number of caveolae (95% decrease) and cholera toxin-labeling was reorganized in dynamic plasma membrane microdomains. Caveolin-1 depletion caused a specific decrease in GLUT4 glucose transporter and insulin receptor protein levels. This reduction was not the result of a generalized defect in adipocyte differentiation or altered gene expression but was explained by faster degradation of these proteins. Caveolin-1 knockdown adipocytes showed reductions in insulin-stimulated glucose transport, insulin-triggered GLUT4 recruitment to the cell surface and insulin receptor activation. In all, our data indicate that caveolin-1 loss-of-function reduces maximal insulin response through lowered stability and diminished expression of insulin receptors and GLUT4. We propose that caveolin-1/caveolae control insulin action in adipose cells