Complexos reguladors amb participació de proteïnes de la família NOD: estudis sobre la interacció entre Citocrom c i Apaf-1 a l'apoptosoma.

[cat] L'apoptosi o mort cel.lular programada és un procés central al desenvolupament, homeòstasi cel.lular, la resposta a l'estrés, l'envelliment i diferents malalties, als organismes eucariotes pluricel.lulars. Una de les vies que regula l'activació de l'apoptosi és la via intrinseca mitocondrial, a la que el citocrom c (Cit c), alliberat des de la mitocòndria en reposta a un estímul proapoptòtic, en presència de dATP indueix l'oligomerizació d'Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) i posterior reclutament de la caspasa-9, conduint a la formació del complex macromolecular activador de l'apoptosi anomenat apoptosoma. Citocroms de diferents vertebrats són equivalents en quant a la seva capacitat d'induir apoptosi a sistemes in vitro, mentre que el de llevat (YCit c) no presenta aquesta activitat. En concret s'ha determinat a partir d'estudis amb mutants derivats de HHCit c (citocrom c de cor de cavall) i YCit c, que els residus de Lys 7, 25, 39 i 72, així com els residus 62-65 dels citocroms de mamífer participen a la interacció amb Apaf-1. En base a aquests antecedents, i dins de la línia de treball iniciada al nostre laboratori encaminada al descobriment de molècules d'interès terapèutic relacionades amb l'apoptosi, es va plantejar com objetiu d'aquesta tesi l'estudi de la interacció entre Cit c i Apaf-1, com un pas preliminar per a l'obtenció de compostos orgànics capaços de modular aquesta interacció. En base als antecedents citats, es va proposar la generació de mutants de YCit c que incorporessin modificacions a la seva regió N-terminal que aproximessin la seva seqüència a la de HHCit c, per dotar-los d'activitat apoptòtica, així com pèptids derivats dels mateixos que mantinguessin unit el grup prostètic hemo. Les mutacions plantejades comprenien la delecció de la cua de cinc residus de l'extrem N-terminal de la seqüència de YCit c (Delta), i la substitució dels residus Ala 7 i Pro 25 d'aquest, per dos residus de Lys (A7K, P25K). Addicionalment es va introduir una Met a la possició 27 (K27M), que permetria generar els hemopèptids derivats dels mutants anteriors per degradació química amb BrCN. Per a la realització dels estudis de funcionalitat d'aquests derivats de YCit c, que comprenien assaigs in vitro d'activació de la caspasa -9 i -3, així com estudis de polarització de la fluorescència, es requeria disposar de la proteïna Apaf-1 en quantitat suficient, pel que es plantejà l'obtenció de dues construccions derivades d'Apaf-1-XL que poguessin expresar-se a E.coli, corresponents als dominis N-terminals CARD- NOD, constitutivament actius, i al C-terminal WDR, responsable de la interacció amb Cit c. Així, es van generar i caracteritzar mitjançant diferents tècniques espectroscòpiques, els mutants derivats de YCit c, YCit c (Delta/A7K/K27M), YCit c (Delta/P25K/K27M) i YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M), així com l'hemopèptid derivat d'aquest, HP 7K25K 1-27. Igualment es van obtenir construccions derivades d'Apaf-1-XL que comprenien els residus 1-570 i 1-572, corresponents als dominis N-terminals, així com les que comprenien els residus 570-1248 i 583-1248, corresponents al domini C-terminal. Els estudis d'activació de caspases en cap cas van posar de manifest una capacitat proapoptòtica dels mutants generats. El mateix resultat negatiu es va obtenir per a l'hemopèptid anterior i pèptids sintètics derivats de la seqüència de HHCit c, sintetitzats al laboratori del grup col.laborador del Dr. E. Pérez- Payá (Centro de investigación Príncipe Felipe, València). No obstant, els estudis de polarització de la fluorescència van posar de manifest la capacitat del mutant YCit c (Delta/A7K/P25K/K27M) d'interaccionar amb Apaf-1. El conjunt d'aquests resultats indicava que les mutacions introduïdes a la seqüència de YCit c eren suficients per induir en aquest la capacitat per interaccionar amb Apaf-1, però no suficients per induir la formació de l'apoptosoma actiu. Per a l'hemopèptid es va determinar una potencial capacitat inhibidora de la formació de l'apoptosoma, que quedava emmascarada per l'efecte oxidatiu del grup prostètic hemo. Aquests mateixos assaigs van permetre establir la funcionalitat per a totes les proteïnes recombinants derivades d'Apaf-1-XL. Amb motiu d'una estada al laboratori del Profesor G. Núñez (University of Michigan, Ann Arbor, EUA) es plantejà un objetiu addicional que va consistir en la determinació dels components del complex de reconeixement del component bacterià muramil dipèptid (MDP), responsable de l'activació de la resposta inflamatòria mediada per Nod2, proteïna de la família NOD, a la que pertany igualment Apaf-1. Així, assaigs d'immunoprecipitació amb derivats del MDP, van indicar una interacció no directa entre aquest i Nod2. Mitjançant cromatografia d'afinitat i posterior anàlisi per espectrometria de masses s'han determinat potencials components del complex de reconeixement del MDP. Addicionalment, estudis preliminars de localizació cel.lular del MDP ha indicat que aquest seria incorporat per les cèl.lules de macròfag per la via endocítica