Beurteilung des Einflusses von Sirolimus und Everolimus auf den Ischämie-Reperfusionsschaden im humanen Gefäßmodell

Systemerkrankungen der arteriellen Gefäße stellen eine häufige Todesursache in Deutschland und der westlichen Welt dar. Hierbei sind vor allem die auf Grundlage von Arteriosklerose entstehende Koronare Herzerkrankung sowie der Myokardinfarkt zu nennen. Ursache des Myokardinfarktes ist eine Minderperfusion und damit bedingte Ischämie des Myokardgewebes. Ziel einer jeden Minderperfusion ist die therapeutisch schnellstmögliche Reperfusion. Ischämie- und Hypoxie-bedingt entstehen hierbei durch inflammatorische Prozesse, Ansammlung toxischer Metabolite, veränderter Protein-Expressionsmuster sowie durch das reperfundierende Blut der sogenannte Ischämie-Reperfusionsschaden. Dieser komplexe Effekt lässt sich über dem hinaus auch bei Organtransplantationen beobachten. Die vorliegende Arbeit beschreibt den Versuch den Ischämie-Reperfusionsschaden durch den Einfluss von mTOR-Inhibition im humanen Gefäßmodel zu quantifizieren. Hierbei wurden die mTOR-Inhibitoren Sirolimus und Everolimus verwendet. Beide Immunsuppressiva finden aktuell unter anderem klinische Anwendung nach Organtransplantationen. Bereits in einigen Studien konnten positive Effekte von Sirolimus als auch Everolimus auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nachgewiesen werden. Dieser Versuch sollte nun weitere zielführende Erkenntnisse hinsichtlich mTOR-Inhibition und proinflammatorischer Prozesse sowie der Expression von Zell-Adhäsionsmolekülen im humanen Gefäßmodell liefern. Ebenso sollte die Qualität des Bioreaktors als adäquates Humangefäß-Perfusionsmodell evaluiert werden. Als Versuchsgrundlage wurde hierbei eine Ischämiezeit der Gefäße von vier bis fünf Stunden festgelegt. Die verwendeten Gefäße wurden in der Folge nach standardisierten Kriterien (Präoxygenierung, Heparinisierung, 37° Grad Celsius Temperatur, Blutgruppe AB Rhesusfaktor negativ, Hämatokritwert 30%) zwei Stunden lang mittels Vollblut im Bioreaktormodel reperfundiert. Unterschieden wurde hierbei eine Gefäßkontrollgruppe (n=7), von einer Sirolimus-Gruppe (n=6, standardisierte Blutkonzentration 10ng/ml) und einer Everolimus-Gruppe (n=7, standardisierte Blutkonzentration 5 ng/ml). Nach standardisierten Zeitpunkten der Reperfusion (0 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten) wurden jeweils Blutproben dem simulierten Kreislauf entnommen. Mittels Blutgasanalyse wurde über die Bestimmung des Sauerstoffpartialdrucks, des Kohlendioxidpartialdrucks sowie des pH-Wertes eine qualitative Evaluierung des Bioreaktors als humanes Gefäßmodel vorgenommen. Des Weiteren dienten die Blutproben zur Erfassung der proinflammatorischer Marker Interleukin-6, TNF-α, sowie VEGF während der unterschiedlichen Zeitpunkte der Blutentnahme. Nach Beendigung der Reperfusion wurden Gefäßproben mittels immunhistochemischen Verfahren auf die Expression der Zell-Adhäsionsmoleküle CD31 sowie CD11b hin untersucht. Aufgrund durchgeführter Versuche konnte gezeigt werden, dass in der Kontrollgruppe die Interleukin-6- sowie VEGF-Spiegel signifikant im Zuge der Reperfusion anstiegen. Sirolimus als auch Everolimus konnten demgegenüber einen signifikanten Anstieg dieser proinflammatorischen Signalmoleküle verhindern. Im Vergleich des proinflammatorischen TNF-α konnte allerdings ein signifikanter Einfluss der mTOR-Inhibitoren nicht bestätigt werden. Hinsichtlich des Expressionsmusters konnte Sirolimus als auch Everolimus eine signifikante Reduktion von sowohl CD31-positiven als auch CD11b-positiven Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe aufzeigen. In der Zusammenschau lässt sich aus den erhobenen Daten schlussfolgern, dass der Bioreaktor als humanes Gefäßmodell ein suffizientes Perfusionssystem darstellt. Sirolimus als auch Everolimus können über ihren Wirkungsmechanismus der mTOR-Inhibition einen Anstieg proinflammatorischen Moleküle zum Teil verhindern. Den größten Einfluss auf den Ischämie-Reperfusionsschaden nehmen Sirolimus als auch Everolimus hierbei mittels der Suppression von Zell-Adhäsionsmolekülen CD31 und CD11b.Arteriosclerosis is a major reason for coronary heart disease and myocardial infarction. These diseases are frequent causes of death in Germany and the Western world. Myocardial infarction is based on hypoperfusion and the ischemia of myocardial tissue. The main treatment of hypoperfusion is the quick reperfusion of ischemic tissue. The Ischemia Reperfusion Injury describes an acute inflammation process which is caused by an Ischemia and Hypoxia period in tissue followed by the accumulation of toxic metabolites and eventually by an inflammatory increase due to the reperfusion through oxygenated blood. The Ischemia Reperfusion Injury plays an important role in the rehabilitation of tissue after cardiac infarcts as well as in the function of transplanted organs. The aim of the present study was to investigate and compare the potential and influence of the mTOR inhibitors Sirolimus and Everolimus upon Ischemia Reperfusion Injury and the inflammatory process in a human bioreactor model. Sirolimus as well as Everolimus are already used for immune suppression after organ transplantations. Positive effects against Ischemia Reperfusion Injury have been shown by the inhibition of the mTOR complex in previous studies. This study wanted to improve the level of scientific knowledge of mTOR inhibition due to the inflammatory processes and expression of adhesion molecules. Furthermore, the quality of the bioreactor as a sufficient perfusion model was investigated. The cold ischemia time was set between a minimum of 4 hours and a maximum of 5 hours. All vessels were reperfused for two hours with standardized heparinzined pre-oxygenated 37°C warm blood of the group AB rhesus factor negative with adjusted haematocrit to a value of 30%. Without any addition of drugs to the reperfusion blood, seven vessels were reperfused (control group, n=7). Six vessels were reperfused by blood which contained Sirolimus with a blood concentration of 10 ng/ml (Sirolimus group, n=6). Moreover, seven vessels were reperfused with an Everolimus blood concentration of 5 ng/ml (Everolimus group, n=7). The reperfusion time was standardized to 2 hours. 0 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes after the start of the reperfusion, blood samples were taken. These samples were used to quantify the development of the oxygen saturation, the pH-value and the carbon dioxide partial pressure during the reperfusion by a blood gas analyzer in order to evaluate the quality of the bioreactor model. In addition, at the same points of time, blood samples were taken to quantify the value of the inflammatory markers Interleukin-6, TNF-α and VEGF. After the reperfusion, biopsies of the vessels were taken to immunohistologically investigate the inflammatory process of the Ischemia Reperfusion Injury through quantification of the adhesion molecules CD31 and CD11b. Our investigation of Interleukin-6 and VEGF demonstrated a significant increase of the Interleukin-6- and VEGF-blood level in the control group during the reperfusion time. In comparison, the experimental groups with addition of Sirolimus respectively Everolimus to the reperfusion-blood showed no significant increase of the Interleukin-6- and VEGF-blood level during the reperfusion. The comparison regarding to the TNF-α blood level in the control group and experimental groups showed no significant differences. Furthermore Sirolimus and Everolimus demonstrated a significant decrease of the adhesion molecules CD31 and CD11b after reperfusion. The rates of CD31 positive cells as well as CD11b positive cells were significantly higher in the control group. As a result, our data indicate that the bioreactor model is a sufficient system to investigate the reperfusion of human vessels. Sirolimus as well as Everolimus demonstrate that mTOR inhibition can help to reduce the Ischemia Reperfusion Injury. The major influence of Sirolimus and Everolimus regarding to the Ischemia Reperfusion Injury are the down regulation of the expression of the adhesion molecules CD31 and CD11b