Development of a capillary electrophoresis method for the determination of timolol in urine of neonates

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Infantile hemangioma (IH) is the most common type of benign tumor affecting children. Although most of the IH are small and localized, some may result in severe complications, which justifies the treatment. Beta-blockers have been currently used as first-line treatment for this pathology. However, there are concerns regarding systemic effects of topical timolol in preterm neonates, a population with increased risk for the development of this pathology. In order to study skin permeation of timolol in preterm infants, a capillary electrophoresis (CE) method to determine timolol was developed in the present work. CE method was optimized using aqueous samples. Parameters related to the buffer (type, pH and concentration) and to the equipment were investigated, including separation voltage and duration of injection. The best CE analysis to detect and separate timolol and propranolol (internal standard) peaks was achieved using phosphate buffer 0.1 M pH 2.0, 10 kV injection voltage, 13 kV separation voltage and duration of injection of 300 s. The method was validated in accordance to ICH guideline- Validation of Analytical Procedures Q2 (R1). Nonetheless, there is still a concern regarding the lack of reproducibility of the method, since elevated standard deviations were obtained and the current was sometimes unstable when separation voltages of 7 and 18 kV and low pH levels were applied. It is important in future experiments to determine the cause of this situation to consolidate the method validation. Since the CE method will be applied to urine samples, a sample pre-treatment method is required. Solid-phase extraction (SPE) using Isolute® ENV+ columns was the method selected. Using this method, peak detection in CE was only possible by applying hydrodynamic injection. SPE alternatives to ENV+ columns have to be investigated, so that the validated CE method can be applied and tested using urine samples.O hemangioma infantil (IH) é a categoria de tumor benigno mais comum em crianças. Entre os fatores de risco para o aparecimento desta patologia encontram-se os recém-nascidos prematuros e de baixo peso, recém- nascidos e crianças do sexo feminino, gestação em idade avançada e gestação múltipla. Embora a maioria dos IH seja pequena e localizada, alguns podem resultar em complicações graves, dependentes da sua dimensão e localização. Bloqueadores- beta têm sido recentemente utilizados como tratamento de primeira linha desta patologia, de forma a evitar a utilização de esteróides, cujos efeitos são sistémicos. Atualmente, o timolol em formulação para aplicação tópica tem vindo a substituir o propranolol, o qual, sendo administrado por via oral, está também associado a efeitos sistémicos. Contudo, existem ainda preocupações relativas a eventuais efeitos sistémicos em resultado da administração de timolol em recém-nascidos prematuros. Esta população possui pele ainda imatura e a sua área de superfície é elevada em relação ao peso corporal, o que promove uma maior permeação do que a pele de adultos. De forma a estudar a permeação da pele de recém-nascidos prematuros ao timolol, um método de determinação de timolol recorrendo a electroforese capilar (CE) foi desenvolvido neste trabalho. O método CE foi escolhido devido ao seu baixo limite de detecção, característica especialmente importante pelo facto de a quantidade de fármaco administrada a recém-nascidos ser muito reduzida, assim como a consequente absorção. Este método analítico de separação de moléculas baseia-se na aplicação de uma corrente eléctrica que irá promover a migração das moléculas, de acordo com a sua carga eléctrica. Os detetores transmitem os picos obtidos para o sistema informático, no computador. A identificação dos compostos é possível devido aos diferentes tempos de migração dos mesmos. Sendo o timolol excretado maioritariamente na urina, esta será a amostra biológica a ser analisada. No entanto, por ainda não ter sido testado um método de purificação da mesma para o efeito, o método CE foi desenvolvido no presente estudo recorrendo a soluções aquosas de timolol e propranolol. O propranolol é utilizado como padrão interno de forma a quantificar a concentração de timolol excretada na urina. Foi escolhido pelas suas características físico-químicas semelhantes às do timolol, o tempo de migração em CE ser aproximado ao do timolol, embora seja eluído em separado, é estável nas condições de análise e pelo facto de não se encontrar inicialmente na amostra a analisar. Neste trabalho foram optimizadas as condições de detecção e separação dos dois bloqueadores-beta em CE, tendo sido testados parâmetros relacionados com a solução tampão (tipo de solução, pH e concentração) e com o equipamento, incluindo a voltagem de separação e a duração da injecção. As amostras foram injectadas nos capilares utilizando injecção electrocinética. A estabilidade da corrente necessária para realizar as análises em CE revelou-se um desafio. A utilização de voltagens de 7 kV e 18 kV, assim como a aplicação de pH baixos gerou, por vezes, instabilidade na corrente, condicionando a reprodutibilidade dos resultados. As melhores condições para detetar e separar timolol e propranolol em CE foram obtidas utilizando tampão fosfato 0.1 M pH 2.0, voltagem de injecção de 10 kV, voltagem de separação de 13 kV e duração de injeção de 300 s. O método foi validado de acordo com a guideline ICH- Validation of Analytical Procedures Q2 (R1). Dado que o desenvolvimento do método CE tem como objetivo a aplicação futura em amostras de urina, é necessário utilizar um método para realizar o pré-tratamento das amostras, de forma a impedir o bloqueio dos capilares do equipamento e a eliminar interferências. O método selecionado para o efeito foi a extração em fase sólida (SPE) com colunas Isolute® ENV+. Neste método as amostras são introduzidas colunas previamente equilibradas. Mediante a aplicação de solvente apropriado o composto em análise será extraído da coluna, apresentando-se numa forma purificada e concentrada. Neste projecto, o metanol revelou ser o solvente de eluição mais efetivo para extrair os analitos da coluna. Contudo, a deteção dos analitos em CE só foi possível recorrendo a injeção hidrodinâmica. Embora o método SPE testado tenha permitido a eluição dos analitos da coluna, os picos de detecção obtidos foram mais pequenos e estreitos comparativamente com aqueles que foram detetados sem que as amostras tivessem sido sujeitas a SPE. Existem vários fatores que podem ter influenciado esta situação, nomeadamente o elevado pH utilizado, a escolha dos solventes e das colunas. Alternativas às colunas Isolute® ENV+ devem ser investigadas, para que a análise seja realizada nos analitos na forma catiónica e a aplicar o método CE validado neste estudo a amostras biológicas de recém-nascidos aos quais está a ser administrado timolol