Epigenetic alterations as mechanism of imatinib resistance in a cellular model of chronic myeloid leukemia

La CML è una patologia mieloproliferativa risultante dall’espansione policlonale di cellule staminali Il trattamento d’elezione è imatinib (IM). Nonostante il successo di IM nel giro di 18-24 mesi, circa il 30% dei pazienti sviluppa resistenza secondaria. Lo scopo del mio progetto è stato quello di indagare i possibili meccanismi genetici ed epigenetici (come la deregolazione dei miRNA e la metilazione aberrante del DNA) per determinare in che modo possano contribuire all’insorgenza di resistenza. Sono state allestite culture cellulari di K562 resistenti ad IM (da 0,05 fino a 3 µM). I miRNA sono stati analizzati per identificare un profilo caratteristico del processo di resistenza, mentre per gli mRNA sono state ricercate alterazioni nell’espressione dei geni addetti al trasporto dei farmaci. Per quanto riguarda il DNA, è stato valutato come variano i livelli di metilazione durante il processo di acquisizione della resistenza analizzando oltre 850.000 siti CpG. Dall’analisi dell’espressione dei trasportatori dei farmaci, è emerso che geni della famiglia dei trasportatori ABC sono sovraespressi nelle cellule resistenti. Per quanto riguarda i miRNA, è emerso che 6 miRNA sono significativamente deregolati: miR-193b-3p, miR-486-5p, miR-512-3p, miR-517a-3p, miR-365a-3p, miR-372-3p. Questi modulano geni appartenenti al pathway di segnalazione di ErbB e PI3K/Akt, coinvolti nei processi di vitalità cellulare, apoptosi, metabolismo e tumorigenesi. Per quanto riguarda la metilazione è stato osservato che, con l’incremento della dose somministrata, il numero di geni metilati aumenta notevolmente e, che in particolare, i geni PTPRF, TP73, ARHGEF10, FHDC1, DUSP6, PLD6 e MIR548H4 sono significativamente ipermetilati nelle cellule resistenti. Conclusioni. Data la recente attenzione rivolta verso il ruolo dei meccanismi epigenetici nell’insorgenza di resistenza, è possibile che un profiling genetico ed epigenetico, che tenga conto di come interagiscono fra loro i trasportatori di efflusso, i miRNA e la metilazione del DNA, possa rappresentare una svolta per la terapia mirata.CML is a myeloproliferative disorder resulting from polyclonal stem cell expansion. The standard treatment is imatinib (IM). Despite the success of IM, within 18-24 months about 30% of patients develop secondary resistance. The aim of my project was to investigate possible genetic and epigenetic mechanisms (as the deregulation of miRNAs and aberrant DNA methylation), to determine how they can contribute to the resistance mechanism. Cell cultures of K562 resistant to IM (0.05 -3 μM) were set up. MiRNA, RNA and DNA were isolated. The miRNAs were analysed with a preformed tool to identify a profiling of the resistance process, while for mRNA alterations in the expression of the genes involved in the transport of drugs were sought. Regarding DNA, we analysed how methylation levels vary during the development of resistance by analyzing over 850,000 CpG sites. From the analysis of the drug transporters, it has emerged that many of the superfamily genes of the ABC transporters are overexpressed in the cells that have acquired resistance. Among these, worthy of note are ABCG2, ABCA3 and ABCC1. Comparing the miRNA expressions to the different concentrations with untreated, we observed that 6 miRNAs are significantly deregulated: miR-193b-3p, miR-486-5p, miR-512-3p, miR-517a-3p, miR-365a -3p, miR-372-3p. These miRNAs modulate genes belonging to the ErbB signaling pathway, involved in the processes of modulation of cell viability, apoptosis, and tumorigenesis mechanism. Regarding methylation, it has been observed that the number of methylated genes increases considerably and the PTPRF, TP73, ARHGEF10, FHDC1, DUSP6, PLD6 and MIR548H4 genes are significantly hypermethylated in resistant cells. Given the recent attention to the role of epigenetic mechanisms in the onset of resistance, it is possible that a genetic and epigenetic profiling, which takes into account how the efflux transporters, miRNAs and DNA methylation interact, can represent a carried out for target therapy