Regulation der Autophagie durch Miz1 in Brustdrüsenzellen und embryonalen Fibroblasten

Die Autophagie beschreibt einen katabolischen Prozess, bei dem für den Abbau bestimmtes Zellmaterial in Autophagosomen eingeschlossen und durch deren Verschmelzung mit Lysosomen zersetzt wird. Durch diesen Selbstreinigungs-Vorgang trägt sie zur Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase bei und hilft durch Bereitstellung von Energielieferanten bei der Anpassung an nährstoffarme Bedingungen. Neben diesen Hauptaufgaben erfüllt die Autophagie außerdem wichtige Funktionen im Rahmen der Zellreifung, Differenzierung und bei der Immunabwehr. Ein gestörter Ablauf des autophagischen Prozesses hingegen ist mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert. Für eine fehlerfrei ablaufende Autophagie ist das Zusammenspiel zahlreicherer Autophagie-assoziierter Proteine notwendig, die durch verschiedene übergeordnete Systeme reguliert werden. In früheren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Miz 1 in die Regulation der Autophagie involviert ist. Sowohl auf morphologischer als auch auf Genexpressionsebene wurden Unterschiede zwischen Zellen mit funktionierendem Miz 1 und solchen mit trunkiertem Miz 1 beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die gefundenen Unterschiede in einem verbesserten Zellmodell reproduziert und außerdem der Einfluss der Interaktion zwischen Miz 1 und Myc auf den autophagischen Prozess untersucht werden. Hierfür wurde zunächst die murine Brustdrüsenzellline HC11 verwendet. Nach Induktion von Autophagie durch Inkubation der Zellen mit nährstoffarmem Medium wurde zuerst der zeitliche Verlauf der Expression von Miz 1 und verschiedener anderer Gene mittels quantitativer Real Time PCR untersucht. Dabei wurde nach einer anfänglichen Hochregulierung der Expression von CDKN1a eine zeitlich versetzte Induktion von Miz 1 und Myc, zusammen mit einer Herunterregulierung von CDKN1a beobachtet. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden HC11 Zellen mit verschiedenen Konstrukten infiziert, um eine Überexpression von Miz 1, Myc bzw. der Myc-Mutante V394D zu erreichen. In dieser Mutante ist eine Interaktion der beiden Transkriptionsfaktoren nicht möglich. Diese infizierten Zellen wurden dann für 6 Stunden mit EBSS behandelt und anschließend immunozytochemisch analysiert. Zur Beurteilung der autophagischen Aktivität wurden LC 3-Färbungen quantifiziert. In Zellen, die Miz 1 überexprimierten, konnte in diesem Experiment eine leicht erhöhte autophagische Aktivität im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle beobachtet werden. Während die Myc-überexprimierenden Zellen durch einen verstärkten Ablauf des autophagischen Prozesses auffielen, unterschieden sich Zellen die das mutierte Myc-Gen trugen kaum von den entsprechenden Kontrollzellen. Diese zuletzt genannten Ergebnisse konnten mittels Elektronenmikroskopie reproduziert werden und sprechen dafür, dass die Interaktion zwischen den beiden Transkriptionsfaktoren für die Regulierung der Autophagie eine Rolle spielt. Auch auf Genexpressionsebene konnten Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien nach Induktion der Autophagie gezeigt werden. Zellen, die MycV394D überexprimierten, zeichneten sich im Vergleich zu Zellen, die mit dem regulären, nicht mutiertem Myc-Vektor infiziert waren, durch eine signifikant erhöhte Expression von Atg 5, Atg 12 und Spast aus. Auch einige andere Gene zeigten unterschiedliche Expressionstendenzen nach Stimulierung der Autophagie in Abhängigkeit von den beiden Konstrukten. Der Versuch einer Herunterregulierung von Miz 1 mittels sh-RNA Interferenz war leider nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Zellmodell etabliert, in dem ein POZ-Domäne-Knockout des Miz 1-Gens mit Hilfe des Östrogen-Rezeptor-Modulators Tamoxifen induziert werden kann. In diesen modifizierten embryonalen Mausfibroblasten wurde im Einklang mit Ergebnissen aus früheren Arbeiten beobachtet, dass ein Fehlen von Miz 1 die Anpassung an nährstoffarme Bedingungen erschwert. Im Unterschied zu den früheren Experimenten, wurden in diesen Zellen jedoch keine Genexpressionsunterschiede für Atg 4c, Atg 5 und Atg 7 in Abhängigkeit von Miz 1 gemessen. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Zelllinie entwickelt, die GFP-markiertes LC 3 bzw. einen entsprechenden Kontrollvektor überexprimieren und zukünftig zum Beispiel für Echtzeituntersuchungen der Autophagie in Abhängigkeit von Miz 1 verwendet werden können. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit nicht nur der Einfluss von Miz 1 auf die Autophagie bestätigt werden, sondern zusätzlich die Relevanz einer funktionierenden Interaktion zwischen den Transkriptionsfaktoren Miz 1 und Myc für diesen essentiellen Prozess aufgezeigt werden