Untersuchungen zur Expression und subzellulären Lokalisation der v-SNARE Isoformen VAMP-1a und -1b

Die sogenannten SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) - Proteine sind essentielle Bestandteile der zellulären Transportmaschinerie und maßgeblich beteiligt an Membranfusionsprozessen, wie z.B. der Fusion zwischen einem Transportvesikel- und seiner Zielmembran. Bei dem auf Transportvesikeln befindlichen vesikulären (v)-SNARE-Protein VAMP-1 (vesicle-associated membrane protein-1) handelt es sich um ein Typ II - Membranprotein, welches aus einem dominanten N-terminalen zytosolischen, einem transmembranen sowie einem kurzen intraluminalen C-Terminus besteht. Es konnte auch für Säugetierzellen gezeigt werden, dass der Mechanismus des alternativen RNA Spleißens zu einer Erhöhung der Zahl verschiedener VAMP-Isoformen beiträgt. Dieser Mechanismus wurde erstmals für das VAMP-1 Gen der Ratte beschrieben, wobei zwei verschiedene in Geweben differentiell exprimierte VAMP-1 Isoformen, VAMP-1a und -1b, identifiziert werden konnten. Die neu charakterisierte VAMP-1b Isoform unterschied sich von der bekannten VAMP-1a Isoform ausschließlich am C-terminalen, intraluminalen Ende und zeigte eine dominante Expression in nicht-neuronalen, insbesondere sekretorisch-aktiven, Geweben wie der Glandula Parotis, wohingegen die bekannte VAMP-1a Isoform eine vorherrschende Expression im Zentralnervensystem aufwies. Ebenfalls wurde berichtet, dass eine ähnliche humane VAMP-1 Spleiß-Isoform, welche ebenfalls eine Veränderung am intraluminalen C-Terminus aufwies, zu Mitochondrien sortierte, was darauf hinweist, dass es sich bei dem C-terminalen Anteil dieser SNARE-Proteine möglicherweise um ein Sortierungssignal handelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, über einen zellbiologischen Ansatz und Nutzung fluoreszenzmikroskopischer Methoden zu untersuchen, ob bei Vergleich beider VAMP-1 Isoformen Unterschiede in der subzellulären Lokalisation nachzuweisen sind, da dies auf eine Rolle des intraluminalen C-Terminus für die Sortierung beider Isoformen in verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweisen würde. Um diesen Fragen nachzugehen, wurden mittels PCR-Klonierung N-terminal GFP- und RFP-markierte VAMP-1a (GFP- und RFP-V1a) und VAMP-1b (GFP- und RFP-V1b) Expressionskonstrukte hergestellt. Diese Konstrukte wurden jeweils als Kombination eines RFP-markierten und GFP-markierten VAMP-1 Konstrukts in HeLa-Zellen kotransfiziert und die subzelluläre Lokalisation der exprimierten Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Es zeigten sich in Bereichen, welche dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi-Apparat entsprechen, eine deutliche Kolokalisation beider Isoformen. Da VAMP Proteine nach Synthese zunächst in die Membranen des ER integriert werden und Unterschiede der Lokalisation erst nach Sortierung im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zustande kommen, war dies zu erwarten, zumal VAMP-1 erst im Bereich des späten sekretorischen Transportwegs funktionell eine Rolle spielt. Peripher zeigten sich jedoch zunehmend auch vesikuläre Strukturen, welche nur eine der beiden Isoformen aufzuweisen schienen. Um die Kolokalisation beider Proteine auch in nicht-fixierten vitalen Zellen zu beurteilen, wurde die Methode der TIRF (total internal reflection fluorescence)-Mikroskopie eingesetzt. Hierzu wurden die Konstrukte in COS-7 Zellen exprimiert, da diese in besonderem Maße für die TIRF-Mikroskopie geeignet sind und eine gute Expression der fluoreszierenden Proteine erlauben. Ähnlich wie zuvor in HeLa-Zellen beschrieben, so wurden auch hier vesikuläre Strukturen beobachtet, welche bevorzugt nur eine der beiden Isoformen exprimierten. Ebenfalls fanden sich Hinweise auf das Vorkommen homotypischer Fusionen zwischen Vesikeln, die sowohl VAMP-1a als auch VAMP-1b exprimierten. Um eine mögliche Lokalisation der zwei VAMP-1 Isoformen in definierten zellulären Kompartimenten des späten sekretorischen Transportweges zu untersuchen, erfolgte eine Transfektion von HeLa-Zellen mit GFP-V1a oder GFP-V1b, sowie nachfolgende Immunzytochemie mit einem Antikörper gegen ein Markerprotein für Mitochondrien (TOM20), frühe Endosomen (EEA1), Lysosomen (LAMP-3) sowie Autophagosomen (MAP LC3beta) bzw. eine Koexpression von RFP-V1a oder RFP-V1b mit dem peroxisomalen Markerprotein GFP-SKL. In den vorliegenden Untersuchungen zeigten sich keine Hinweise für eine Sortierung beider VAMP-1 Isoformen zu Mitochondrien oder Peroxisomen. Beide Isoformen waren jedoch vereinzelt in mit frühen Endosomen, Lysosomen sowie Autophagosomen assoziierten Vesikeln nachweisbar. Aufgrund der Beobachtung vesikulärer Strukturen, welche nur eine der transfizierten VAMP-1 Isoformen aufzuweisen scheinen, ist es daher möglich, dass nur eine der beiden Isoformen in ein noch nicht näher definiertes Kompartiment sortiert. Weiterführende Untersuchungen, die andere Methoden, wie z.B. subzelluläre Fraktionierung, einsetzen, könnten dazu beitragen, diese Kompartimente näher zu definieren