Posttranslationale Modifikation und subzelluläre Verteilung von Plakophilin 3 in normalen und Tumorzellen

Die zelluläre Adhäsion stellt einen Eckpunkt für den evolutionären Erfolg mehrzelliger Organismen dar. Die Spezialisierung einzelner Zellen und das Entstehen komplexer funktioneller Einheiten manifestiert sich in verschiedensten Zell- und Gewebstypen. Desmosomen und Adhärenzverbindungen sind für die Bildung und Aufrechterhaltung dieser Gewebsstrukturen unerlässlich und ermöglichen auch deren funktionelle Dynamik. Eine wichtige strukturelle Komponente dieser Zell-Zell-Verbindungen sind Armadillo-Proteine. Diese fungieren allerdings nicht ausschließlich als Zelladhäsionsmoleküle, sondern übernehmen auch weitere zelluläre Aufgaben. Die verschiedenen funktionellen Eigenschaften der Armadillo-Proteine werden meist durch spezifische posttranslationale Modifikationen reguliert. Für einige Mitglieder der Proteinfamilie existieren bereits umfangreiche Studien, die sich mit der Dynamik der Moleküle infolge spezifischer Phosphorylierungen auseinandergesetzt haben. Regelmäßig wurden bei diesen Analysen Kinasen der Src-Familie und der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor als katalysierende Proteine identifiziert. Im Zuge dieser Arbeit wurde das desmosomale Armadillo-Protein Plakophilin 3 auf das Vorhandensein von Proteinmodifikationen in normalen und Tumorzellen hin analysiert. Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (IEF) wurde gezeigt, dass Plakophilin 3 Ziel post-translationaler Modifikationen ist, die sich zumindest teilweise auf Tyrosin-Phosphorylierungen zurückführen ließen. Aus einer entsprechenden Datenbank von Phospho-Proteinen wurden für Plakophilin 3 fünf Tyrosin-Reste und ein Serin-Rest, die einerseits häufig in Phosphoanalysen nachgewiesen wurden und andererseits von Relevanz für die Funktion des Proteins sein könnten, ausgewählt. Diese sechs Aminosäure-Reste wurden in Mutagenese-Experimenten substituiert und zur Konstruktion von PKP3-Einzelmutanten und PKP3-Kombinationsmutanten verwendet. Epitheliale Zellen wurden mit diesen unterschiedlichen PKP3-Konstrukten stabil transfiziert und mittels Immunofluoreszenz-Färbung und differentieller Extraktion untersucht. Eine funktionelle Bedeutung hinsichtlich der PKP3-Eigenschaften einzelner Modifikationen konnte hierbei bislang nicht nachgewiesen werden. Des weiteren wurden gegen die phosphorylierten Plakophilin 3-Sequenzen polyklonale Antiseren hergestellt. Aus einem der Seren konnten ausreichend sauber Phospho-spezifische Antikörper gegen den Tyrosin-Rest Y195 aufgereinigt werden. Mit Hilfe dieses Antikörpers wurde die Phosphorylierung von Plakophilin 3 an Y195 in in-vivo und in-vitro Experimenten untersucht. Plakophilin 3 wurde dabei durch Einsatz spezifischer Kinase-Inhibitoren und in einem in-vitro Kinase-Assay als neues Substrat der c-Src-Kinase identifiziert. Hierbei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung dieses Tyrosin-Restes streng reguliert wird und erst durch den Einsatz des Tyrosin-Phosphatase-Inhibitors Pervanadat detektiert werden kann. Wachstumsfaktoren wie EGF, IGF-1 oder HGF führten erstaunlicherweise zu keiner Phosphorylierung des spezifischen Tyrosin-Restes. Allerdings konnte die Tyrosin-Phosphorylierung durch Stimulation der Zellen mit Wasserstoff-Peroxid induziert werden. Dies legt nahe, dass PKP3 ein Zielmolekül des Src-vermittelten Signalwegs darstellt, welches in Abhängigkeit von reaktiven Sauerstoff-Spezies und oxidativem Stress an Y195 phosphoryliert wird. Immunfluoreszenz-Färbungen an c-Src-überexprimierenden Zellen zeigten, dass Y195-phosphoryliertes PKP3 an der desmosomalen Struktur lokalisiert. An dieser Stelle sind allerdings weitere funktionelle Untersuchungen notwendig, da die Tyrosin-Phosphorylierung von Plakophilin 3 in einigen Versuchen mit einem veränderten zellulären Löslichkeitsverhalten in Verbindung zu stehen schien, wobei diese Beobachtung bisher nicht mit einer einzelnen, spezifischen Phosphorylierung korreliert werden konnte. Somit hat die vorliegende Studie erstmals für das desmosomale Protein Plakophilin 3 die Existenz einer spezifischen Tyrosin-Phosphorylierung und einen damit assoziierten Signalweg aufgezeigt, deren zellbiologische Relevanz in weiterführenden Experimenten zu klären ist. Hinsichtlich maligner Tumoren konnte in früheren Arbeiten an Prostatakarzinomen ein höherer Malignitätsgrad sowohl mit einer erhöhten c-Src-Kinaseaktivität als auch mit einer gesteigerten Expression von Plakophilin 3 korreliert werden. Unter Berücksichtigung unserer experimentellen Daten wurden daraufhin Adenokarzinome der Prostata hinsichtlich des Auftretens der spezifischen Phosphorylierung von Plakophilin 3 immunhistochemisch untersucht. Hier wurde Y195-phosphoryliertes PKP3 in bestimmten Tumorarealen einiger schlecht differenzierter Adenokarzinome entlang von Zellgrenzen gefunden. Ob die untersuchte Modifikation unter Umständen eine diagnostische Relevanz hat, muss in weiterführenden Untersuchungen bestimmt werden