Identifizierung von Inhibitoren der Wachstumsarrest induzierenden Funktion von Miz1 und Charakterisierung von 14.3.3eta als Inhibitor der Funktion von Miz1

Der mit Myc interagierende Transkriptionsfaktor Miz1 wird für die transkriptionelle Aktivierung der Cdk-Inhibitoren p15Ink4b und p21Cip1 benötigt. Durch die Aktivierung dieser Gene induziert Miz1 in Zellen einen Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus. Myc inhibiert die Miz1-abhängige Induktion des G1-Arrestes durch Ausbildung eines Komplexes mit Miz1, wodurch Myc die Transaktivierungsaktivität von Miz1 hemmt. In der vorliegenden Arbeit wird ein retrovirales Screen-Verfahren beschrieben, daß mit dem Ziel durchgeführt wurde neue Gene zu identifizieren und charakterisieren, die für Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 kodieren. Dazu wurde eine humane cDNA-Expressionsbibliothek retroviral in Rat1- Fibroblastenzellen infiziert, die zusätzlich mit Miz1 exprimierenden Retroviren superinfiziert wurden. Der eingesetzte Titer der Miz1 exprimierenden Retroviren, führte zu einem vollständigen Wachstumsarrest in parentalen Rat1-Fibroblasten. Die Identität der cDNA-Insertionen der erhaltenen Zellklone wurde mittels PCR-Technik und Sequenzierung ermittelt. Es wurde insgesamt siebenmal eine für c-Myc kodierende cDNA und zweimal eine für ein Fragment des gamma Actin kodierende cDNA isoliert. Es konnte in allen analysierten Zellklonen eine bestehende ektopische Expression von Miz1 nachgewiesen werden. Die Isolierung vollständiger Gensequenzen mit einer Inhibitionsfunktion demonstrieren, daß das durchgeführte Screen-Verfahren technisch gut funktioniert hat. Jedoch führte die Ermittlung der cDNAs als humane c-Myc Sequenzen als Inhibitor des Miz1 induzierten Wachstumsarrestes nicht zu neuen Erkenntnissen, da diese Interaktion bereits bekannt und untersucht war (Peukert et al., 1997). Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von 14.3.3eta, als Inhibitor der Funktion von Miz1. Dabei handelt es sich um eine Isoform der 14.3.3 Proteinfamilie, die in Säugern insgesamt neun Mitglieder umfaßt. 14-3-3eta wurde als potentieller Kandidat in einem anderen retroviralen Screen-Verfahren gefunden, das ebenfalls zur Identifizierung neuer Inhibitoren der wachstumshemmenden Funktion von Miz1 durchgeführt wurde. Dazu wurde eine retrovirale cDNA-Expressionsbibliothek eingesetzt, um gezielt nach Inhibitoren zu suchen, die das langsame Wachstum von Zusammenfassung 124 Miz-1 überexprimierenden Rat1-Fibroblastenzellen überwinden können. Die Überexpression von 14-3-3eta hemmt den Miz1-induzierten Wachstumsarrest in der G1-Phase des Zellzyklus durch Inhibition der Miz1-abhängigen Genaktivierung der der Cdk-Inhibitoren p15INK4B und p21CIP1, ähnlich wie Myc und TopBP1. Darüber hinaus antagonisiert 14.3.3eta auch die Apoptose in Rat1-Fibroblsaten, die durch eine Überexpression von Miz1 induziert wird. Es konnten in der Sequenz von Miz1 zwei potentielle Bindemotive für die Bindung von 14.3.3 Proteinen, sogenannte Mode I Motive, ermittelt werden, die in der Nähe und innerhalb der DNA-bindenden Domäne liegen. In dem ersten Motiv befindet sich an Position 291 ein phosphorylierbares Threonin und im zweiten Motiv an Position 428 ein phosphorylierbares Serin. 14-3-3eta bindet über diese beiden Motive direkt an Miz1. Punktmutanten von Miz1, die nicht mehr an 14-3-3eta binden können, demonstrieren, daß die Hemmung der Miz1-abhängigen Genaktivierung von p21Cip1 und p15Ink4b durch 14-3-3eta von den beiden Erkennungsmotiven abhängt. Dabei ist die Hemmung von der Phosphorylierung der Aminosäuren Threonin291 und Serin428 abhängig. Mechanistisch erfolgt die Hemmung von Miz1, indem 14-3-3eta die Bindung von Miz1 an die Initiator Elemente der Zielgen-Promotoren verhindert. Die zelluläre Lokalisation von Miz1 wird durch die Interaktion mit 14-3-3eta nicht verhindert. Die Vorraussetzung der Interaktion von 14-3-3eta mit seinen Liganden ist die Phosphorylierung der Serin/ Threonin Reste in den Erkennungsmotiven. Die Phosphorylierung des Serin428 in Miz1 erfolgt durch die Akt/ PKB Kinase und ist notwendig für die Interaktion von 14-3-3eta und Miz1 und die daraus resultierende Inhibition der Funktion von Miz1. Genexpressionsanalysen zeigten, daß Miz1 zwei veschiedene Funktionen in der Regulation der Genexpression besitzt. Zum einen ist Miz1 für die nach DNASchädigung erfolgende Aktivierung einer großen Gruppe von Genen notwendig. Diese Funktion wird durch Myc, aber nicht durch Akt/ 14-3-3eta reguliert. Zum anderen reprimiert Miz1 eine Gruppe von Genen nach Schädigung der DNA. Diese reprimierende Funktion wird durch Akt/ 14-3-3eta aber nicht durch Myc reguliert. Die Akt-abhängige Phosphorylierung von Miz1 und die darauf folgende Bindung von 14-3-3eta scheint in der Regulation des Zellzyklusarrestes während der DNA-Schadensantwort eine wichtige Rolle zu spielen