Qualitativer Nachweis von CCM1, CCM2 und CCM3 sowie die Analyse morphologischer und proliferativer Veränderungen nach Verringerung der Expression von CCM1 in HUV Endothelzellen

Kavernome sind vaskuläre Neubildungen im zentralen Nervensystem, welche aus dilatierten, dünnwandigen, sinusoidalen Blutgefäßen bestehen. Histologisch zeigen sich nur anormal vorhandene oder gänzlich fehlende Tight Junctions der Endothelzellen und teilweise fehlende astrozytische Fortsätze, was zu einer Vergrößerung der Zwischenräume der Zellen führt. Klinisch weisen die Patienten zerebrale Blutungen, Krampfleiden oder fokale neurologische Defizite auf. Die Prävalenz des Kavernoms beträgt 0,5%, von diesen weisen jedoch nur 20 bis 30% klinische Symptome auf. Das Kavernom tritt sowohl sporadisch als auch autosomal dominant vererbt auf. Die familiären Fälle stehen im Zusammenhang mit drei Genen und deren, zu einem Funktionsverlust führenden, Mutationen. Mutationen in CCM1 sind für 40 bis 50% der familiären Fälle verantwortlich, in CCM2 für 10 bis 20% und in CCM3 für etwa 40%. Das Modell der Entstehung des Kavernoms gründet sich auf dem von Knudson erstellten two-hit Mechanismus und wird von murinen Forschungsergebnissen mit Ccm1+/- Trp53-/- doppelt mutierten Mäusen unterstützt. Sowohl CCM1 (KRIT1) als auch CCM2 (Malcavernin) sind in den β1 Integrin Signalweg eingebunden, welcher unter anderem Zelladhäsion, Zellmigration und Zellproliferation reguliert. Außerdem sind beide Gene an der Aktivierung der p38MAPK beteiligt, von welcher murine Forschungsergebnisse zeigen konnten, dass Mäuse ohne p38αMapk signifikante Defekte in der plazentalen Angiogenese und in der Entwicklung der Blutgefäße, besonders im Bereich des Kopfes, aufwiesen. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass CCM3 (PDCD10) mit dem ERK Signalweg, welcher ebenfalls Einfluss auf Zellproliferation und Transformation hat, interagiert. Ziel der Arbeit war es, die Expression der CCM Gene nachzuweisen und dadurch die Theorie, dass Endothelzellen in der Pathogenese des Kavernoms eine Hauptrolle spielen, zu unterstützen. Außerdem sollte ein Zellkultursystem erstellt werden, welches uns die Möglichkeit gibt, funktionelle Veränderungen der Endothelzellen nach Runterregulation von CCM1 festzustellen. Mittels Echtzeit RT-PCR konnte nachgewiesen werden, dass HUV Endothelzellen alle drei CCM Gene exprimieren. Außerdem war es möglich, ein Zellkultursystem in HUV Endothelzellen zu etablieren, in welchem CCM1 erfolgreich runterreguliert werden konnte. Validiert wurde dieses System ebenfalls mittels Echtzeit RT-PCR. Nachfolgend wurden Veränderungen der Morphologie und der Proliferation erfasst. Morphologisch zeigten sich die Zellen nach Transfektion größer und spindelförmiger als die Kontrollen, und sie bildeten vermehrt strangförmige Strukturen. Diese Beobachtungen ähnelten Zellen isoliert aus Kavernomen in Angiogenese-Assays. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass der Verlust der Funktion von CCM1 in Endothelzellen die Hauptrolle in der zum Kavernom führenden Veränderung spielt. Im Proliferationsassay ließ sich eine Verringerung der Proliferationsrate feststellen, welche zeigt, dass ein Funktionsverlust von CCM1 einen direkten Einfluss auf die Zellproliferation hat