Die neue TMG-Proteinfamilie : rekombinante Proteinsynthese und Ligandensuche

Das Thema der Arbeit, die Identifikation eines möglichen Interaktionspartners für eine neue Familie γ-carboxylierter Proteine, wurde umfangreich untersucht. Für die erforderte Ligandensuche wurden zuerst verschiedene Proteinkonstrukte erfolgreich in humanen Nierenzellen (HEK293-Zellen) exprimiert. Die Proteinexpression erforderte obligatorische Modifikationen der Proteinsequenz, um stabile und potentiell funktionsfähige Moleküle zu erhalten. Die Expression der Ektodomäne als Albuminfusion war ein Novum. Es wurden sowohl modifizierte Fusionsproteine exprimiert, als auch nicht modifizierte, native, membranständige Gla-Proteine. Die Reinigungsentwicklung orientierte sich an etablierten Reinigungsverfahren γ-carboxylierter Proteine. Das Reinigungsverfahren erzielte eine ausreichende Reinheit der gewünschten Proteinsequenz und die enthaltene Fraktion der Gla-FP war zu 95% γ-carboxyliert. Die γ-Carboxylierung war das wichtigste Kriterium für die potentielle Funktionsfähigkeit der Ektodomänen. Die Familie der membranständigen Gla-Proteine besitzt eine Ektodomäne, welche mit dem Gefäßsystem des Menschen in Kontakt steht. Die Ligandensuche erfolgte deshalb im humanen Plasma. Mit vielfältigen Methoden wurde versucht Liganden für die Gla-Proteine zu finden. Die Suche nach diesem erfolgte durch Bindungsassays auf zellulärer und plasmatischer Ebene. Es wurden Bindungsassays mit SPR-Methoden als auch Identifizierungversuche mit Magnetic Beads in Kombination mit Massenspektrometrie durchgeführt. Die zellulären Assays basierten auf der Annahme, dass kein Bindungspartner im Plasma identifiziert werden konnte. Die Hauptzellarten des Blutes, Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten, wurden untersucht. Mit Thrombozyten zeigten sich gerinnungsähnliche Vorgänge, welche einer Gelbildung von aktivierten Thrombozyten entsprachen. Zusätzlich zur Ligandensuche fand erstmals überhaupt der fluoreszenzmikroskopische Nachweis der Lokalisation der nativen, nicht modifizierten Gla-Proteine in der Zellmembran statt. Ein Ligand für die Gla-Proteine wurde auf molekularer Ebene nicht gefunden; auch führten zelluläre Bidnungspartner nicht zum gewünschten Bindungsergebnis mit einem in der Zellmembran der untersuchten Zellen lokalisierten Protein. Dennoch gibt es Überlegungen für weiterführende Ansätze. Denkbar sind Interaktionen mit small molecules oder ionischen Verbindungen, welche mit den eingesetzten Methoden nicht detektiert werden konnten. Möglicherweise muss auch ein Rezeptorverbund als Bindungsschnittstelle vorhanden sein, welcher ebenfalls nicht mit den vorhandenen Methoden getestet werden konnte. Auch mehrstufige zelluläre Prozesse konnten nicht abgebildet werden. Die offenen Fragen bieten Ansätze für weitere Forschungsprojekte, welche in der Schlussfolgerung näher ausgeführt werden