Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung zwischen GLP-1 und dem GLP-1 Rezeptor mit Hilfe von Site-directed Mutagenesis des GLP-1 Rezeptors und des Glukagon Rezeptors

Die Probleme, die die Therapie der Volkskrankheit Diabetes mellitus aufwerfen, sind noch lange nicht gelöst. Das Hormon GLP-1(7-36)amid ist seit Jahren ein viel untersuchter Kandidat für die Therapie des Diabetes mellitus. Es hat vilefältige positive Wirkungen auf den Glukosehaushalt und im Vergleich zu anderen Antidiabetika geringe Nebenwirkungen. So führt es z.B. nicht zu der gefürchteten Hypoglykämie. Leider weist GLP-1 aber auch Eigenschaften auf, die die Nutzung des Hormons als Therapeutikum erschweren. So hat GLP-1 unter anderem nur eine geringe Halbwertzeit im Blut und wird schlecht vom Darm absorbiert. Daher ist es notwendig, diese Hormon und die Struktur-Wirkungsbeziehung zwischen GLP-1 und seinem Rezeptor zu untersuchen, um so mögliche Angriffspunkte für die Entwicklung synthetischer, als Therpeutikum nutzbarer Analoga zu finden. Der GLP-1 Rezeptor gehört in eine kleine Untergruppe der grossen Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit sieben transmembranären Domänen, den Klasse B Sekretin-ähnlichen Rezeptoren. Sie weisen untereinander eine grosse Homologie auf. In dieser Arbeit wurde das Wissen um die Struktur-Wirkungsbeziehung dieser Rezeptoren un ihrer Hormone genutzt, um mehr über GLP-1 und seinen Rezeptor zu erfahren. So konnte erstmals gezeigt werden, dass der GLP-1 Rezeptor nicht wie der Sekretin Rezeptor seine Selektivität verliert, wenn das Lysin an Position 197 gegen das nicht konservierte Isoleucin an der entsprechenden Position 195 des Glukagon Rezeptors ausgetauscht wird. Er verliert durch diese Veränderung sogar fast komplett die Fähigkeit, ein Signal in die Zelle weiterzugeben. Dazu wurden mit Hilfe von rekombinanter PCR die Chimäre [I197]-GLP-1 Rezeptor und [K195]-Glukagon Rezeptor hergestellt und durch Sequenzieren auf Richtigkeit überprüft. COS-7 Zellen wurden transient mit diesen Chimären und den Wildtyp Rezeptoren transfiziert. Erfolgreiche Transfektion wurde durch Western blot bestätigt. Weiterhin wurden unter Befolgung der Fmoc/tBu Strategie vier Peptide nach der Fest-Phasen Methode mittels eines SyRo II "multiple peptide synthesizers" synthetisiert: GLP-1, Glukagon und die 2 Analoga [Q9]-GLP-1 und [E3]-Glukagon, bei denen die Aminosäuren Glutaminsäure und Glutamin an Position 3 ihrer Wildtyp Hormone förmlich miteinander ausgetauscht wurden. Um so zu überprüfen, ob diese Aminosäuren an Position 3 mit Lysin 197 oder Isoleucin 195 ihrer Wildtyp Rezeptoren interagieren und diese Aminosäuren der Rezeptoren wiederum für die Selektivität ihrer Ligandenwirkung verantwortlich sind, wurde versucht, Bindungsassays und cAMP-Assays mit allen möglichen 16 Kombinationen von Ligand und Rezeptor durchzuführen. Für die Bindungsassays wurden die Liganden nach der von Göke und Conlon beschriebenen Iodogenmethode mit 125Jod markiert. Dabei zerbrach das Analogon [E3]-Glukagon wiederholt, so dass für die Bindungsassays nur 12, für die cAMP-Assays alle 16 Kombinationen durchgeführt werden konnten. Durch den Verlust der Zellaktivierung beim GLP-1 Rezeptor nach Austausch einer einzelnen Aminosäure war es nicht möglich, eine Aussage über die Interaktion zwischen der Glutaminsäure an Position 3 des GLP-1 und des Lysins an Position 197 des GLP-1 Rezeptors zu machen. Es konnte aber erstmals gezeigt werden, dass die Carboxy-Gruppe der Glutaminsäure an Position 3 des GLP-1 essentiell für die Zellaktivierung durch den GLP-1 Rezeptor ist. Ausserdem konnte nachgewiesen werden, dass das Isoleucin 195 des Glukagon Rezeptors wichtig für die Zellaktivierung duch Glukagon ist. Es konnte auch gezeigt werden, dass das Glutamin an Position 3 des Glukagons nicht essentiell für die cAMP-Produktion der Zelle ist und nicht speziell mit dem Isoleucin 195 des Glukagon Rezeptors in Interaktion tritt