Kälteschockantwort von Bacillus subtilis - Supercoil-regulierte Kälteschockproteine und die kälteinduzierten DEAD-box RNA-Helikasen CshA und CshB

Sinkende Umgebungstemperaturen lösen bei Mikroorganismen eine Kälteschockantwort aus. Zur Untersuchung dieser Kälteschockantwort in grampositiven Mikroorganismen wird das mesophile Bodenbakterium Bacillus subtilis als Modellorganismus verwendet. Als Kälteschock wird dabei ein Temperaturabfall von 37 °C auf 15 °C definiert. Nach einem solchen Kälteschock verändert B. subtilis die Genexpression, um seine Zellphysiologie an die neuen Umweltbedingungen anzupassen. Diese Anpassung ermöglicht das Überleben bei niedrigen Temperaturen, indem kälteempfindliche Systeme durch die Induktion kälteprotektiver Proteine geschützt werden. Zu den bekannten kälterelevanten Systemen zählen neben der Fluidität der Membran die veränderte DNA Topologie und die gehinderte Initiation der Translation. Nach einem Kälteschock erhöht sich in B. subtilis der Grad der negativen Superspiralisierung der DNA. Diese gesteigerte negative Superspiralisierung hat eine veränderte Genexpression zur Folge. In der vorliegenden Arbeit sollte mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese untersucht werden, welche Genprodukte in der Kälte von der veränderten Superspiralisierung abhängig sind. Um diese Proteine identifizieren zu können, wurde die für die Einführung der negativen Superspiralisierung verantwortliche Gyrase durch Zugabe des Cumarin Derivats Novobiocin gehemmt. Anschließend wurde das Proteom des B. subtilis JH642 bei 37 °C und bei 15 °C mit und ohne Novobiocin verglichen. Durch diesen Vergleich konnten acht kälteinduzierte, von der negativen Superspiralisierung abhängigen Gene identifiziert werden. Einige dieser Gene wurden dann durch Gendeletionsstudien auf ihre Beteiligung an der Kälteschockanpassung hin untersucht. Ein kältespezifischer Phänotyp konnte für eine fabI-Mutante beobachtet werden. FabI ist eine Enoyl-[Acyl-Carrier-Protein] Reduktase, die am Elongationszyklus der Fettsäurebiosynthese beteiligt ist. Dort werden neben den linearen Fettsäuren auch verzweigtkettige Fettsäuren verlängert, die zur Anpassung der Membran an niedrige Temperaturen verwendet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die kälteinduzierten Proteine CshA und CshB aus B. subtilis untersucht, die in Sequenzvergleichen eine hohe Homologie zu DEAD Box RNA Helikasen aufweisen. In dieser Arbeit wurden sie durch einen ATPase Test und die Entwindung artifizieller dsRNA als ATP abhängige DEAD Box RNA Helikasen charakterisiert. Des Weiteren konnten durchgeführte fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von GFP-Fusionen die transkriptionsabhängige Lokalisation der Helikasen CshA und CshB an den Zellpolen zeigen, was auch schon für die CSPs bekannt war. Untersuchungen einer cshB/cspD Doppelmutante zeigten ein vermindertes Wachstum bei niedrigen Temperaturen im Vergleich zum Wildtyp JH642. Weiterhin konnte die postulierte Zusammenarbeit von Helikasen und CSPs durch FRET Messungen der CFP- bzw. YFP Fusionen der Proteine in vivo nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstützen das Modell, in dem die RNA-Helikasen kältestabilisierte Sekundärstrukturen der mRNA entwinden. Danach kann die mRNA von den CSPs gebunden werden, wodurch die Translationsinitiation bei niedrigen Temperaturen erleichtert wird