Iterative NRPS-Systeme-Charakterisierung der Gramicidin S-Thioesterase und Analyse der Thiocoralin-3-Hydroxychinaldinsäure-Biosynthese

Bakterielle, fungale und pflanzliche multimodulare Enzyme generieren eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten mit pharmakologisch interessanten Eigenschaften. Zur fermentativen, semisynthetischen oder chemoenzymatischen Darstellung dieser Naturstoffe und deren optimierten Derivaten ist ein detailliertes Wissen ihrer Biosynthese oder der beteiligten Enzyme Vorraussetzung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten wichtige Aspekte der Biosynthese der iterativen nicht ribosomalen Produkte Gramicidin S, ein potentes Antibiotikum, und Thiocoralin, ein Anti-Tumor-Mittel, geklärt werden. Iterative nicht ribosomale Produkte zeichnen sich durch eine aus repetitiven Einheiten aufgebaute zyklische Struktur und den Einbau von nicht-proteinogenen Bausteinen aus. Sowohl die hieraus resultierende rigide Struktur als auch die Eigenschaften der nicht-proteinogenen Bausteine sind für die biologische Aktivität oft entscheidend. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Schlüsselreaktion einer iterativen nicht ribosomalen Peptidsynthetase, die Thioesterasen-katalysierte Verknüpfung der repetitiven Einheiten und die anschließende Zyklisierung, untersucht. Hierzu wurde die rekombinante Gramicidin S Thioesterase aus Bacillus brevis in E. coli heterolog exprimiert und mit einen chemoenzymatischen Ansatz charakterisiert. Die Umsetzung verschiedener Peptidylthioestersubstrate zeigte hierbei, dass die Thioesterase in vitro sowohl eine Ligation als auch eine Zyklisierung katalysiert. Das Auftreten eines linearen N Acetylcysteamin aktivierten Ligationsintermediates lässt einen in vivo-Mechanismus vermuten, indem das Ligationsprodukt zunächst an die nebenstehende Peptidyl Carrier Protein Domäne gebunden vorliegt und erst anschließend wieder auf die Thioesterase zur Zyklisierung übertragen wird (Backward Mechanismus). Durch Inkubation mit Peptidylthioestersubstraten verschiedener Länge konnten neben Dimerisierungen auch Trimerisierungen beobachtet werden, die durch anschließende Zyklisierung zu verschiedenen Zyklusgrößen führten. Das biokombinatorische Potential der Thioesterase wird durch die Umsetzung von Substratmischungen, die zu Zyklen aus unterschiedlichen Substraten aufgebaut werden, deutlich. Weiterhin wurde das Ligationspotential der Thioesterase untersucht und als längstes Produkt ein Heptadekapeptid erhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Schlüsselschritt der 3-Hydroxychinaldinsäure Biosynthese untersucht. Dieses Pharmakophor ist für die DNA-bisinterkalativen Eigenschaften des Anti-Tumor-Wirkstoffes Thiocoralin entscheidend. Durch heterologe Expression der Proteine TioI, TioG, TioF, TioK und der Peptidyl Carrier Protein Domäne (PCP Domäne) von TioK sowie die in vitro-Umsetzung mit möglichen Substraten konnten Schlüsselschritte der Biosynthese geklärt werden. So zeigen die Ergebnisse, dass, entgegen der postulierten Biosynthese, TioI die β-Hydroxylierung von PCP Domänen-gebundenem Tryptophan katalysiert und dass nach erfolgter Abspaltung des β-Hydroxytryptophans von der Synthetase TioK die weiteren Biosyntheseschritte katalysiert werden