Identifizierung und Charakterisierung von peripheren Membranproteinen der Zymogengranula des exokrinen Pankreas der Ratte durch subgranuläre Proteomanalyse

Das exokrine Pankreas ist eine tubuloazinöse Drüse, deren Azinuszellen die Verdauungsenzyme (Zymogene) synthetisieren, in Zymogengranula sortieren und reguliert sezernieren. Die Zymogengranula werden am Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) gebildet, wobei nur wenige Informationen über die spezifische Interaktion der Zymogenaggregate mit der Membran des TGN vorliegen. Fehler bei der Zymogensortierung und –inaktivierung können zu proteolytischen Prozessen innerhalb der Azinuszellen und nachfolgend zu schwerwiegenden klinischen Krankheitsbildern beitragen. Kenntnisse über den molekularen Aufbau der Granulamembran sowie die Art und Funktion der Membranproteine der Zymogengranula sind daher sowohl von zellbiologischer als auch klinischer bzw. therapeutischer Bedeutung. Die Proteine der Wash-Fraktion (= periphere Membranproteine) ergeben nach 2D-gelelektrophoretischer Auftrennung ein charakteristisches und reproduzierbares Proteinspotmuster, das sich vom Verteilungsmuster anderer Granulasubfraktionen unterscheidet, und lassen sich in eine saure und eine basische Proteingruppe einteilen. Insgesamt wurden 103 reproduzierbare Proteinspots mehrfach analysiert. Von den Proteinen der sauren Gruppe konnten bisher 39% identifiziert werden, was vermutlich auf posttranslationale Modifikationen zurückzuführen ist. Durch Glykostaining-Methoden konnte ich nachweisen, dass die Proteine der sauren Gruppe im Gegensatz zu denen der basischen glykosyliert sind. Zu den identifizierten Proteinen gehören typische Inhaltsproteine der Zymogengranula (z. B. RNAse A) (24%), ein großer Anteil lipidbindender Proteine (41%) sowie periphere Membranproteine der Zymogengranula (16%) (z. B. Annexin IVa, das Ezrin-Radixin-Moesin-(ERM)-binding phosphoprotein, Syncollin, das sekretorische Lektin ZG16p). Der große Anteil lipidbindender Proteine innerhalb dieser Fraktion erklärt sich vermutlich durch die Affinität dieser Proteine zu Membranlipiden, das Auftreten von Inhaltsproteinen der Zymogengranula innerhalb der Wash-Fraktion könnte durch die Interaktion mit der postulierten submembranösen Matrix zustande kommen. Einige der identifizierten Proteine sind mitochondrialen Ursprungs (11%) und stellen Untereinheiten von ATP-Synthase und Cytochrom-c-Oxidase dar, die auch andere Arbeitsgruppen identifizierten. Aber auch Proteine, die bisher nicht in ZG beschrieben wurden, konnten identifiziert werden. Hierzu gehört die Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase B (PPIB), ein klassisches ER-ständiges Protein, sowie die Chymase (RMCP-1), eine mastzellspezifische Serin-Protease, die beide der basischen Gruppe zugeordnet werden. Verschiedene identifizierte Proteine wurden näher charakterisiert. Durch Einsatz spezifischer Antikörper konnte die mastzellspezifische Chymase (RMCP-1) im 2D-Immunoblot sowie nach Granulasubfraktionierung eindeutig als peripheres Membranprotein der Zymogengranula nachgewiesen werden. Andere mastzellspezifische Proteine (z. B. Tryptase) wurden in den Granulafraktionen nicht detektiert. Quantitative PCR-Studien zeigten für die Chymase eine Abhängigkeit der Transkriptionsrate vom Fütterungsverhalten der Tiere. Morphologische Studien wiesen die Chymase auf histologischer als auch elektronenmikroskopischer Ebene als Zymogengranula-assoziiertes Protein aus. Die Chymase wird nicht in AR42J-Zellen, einem exokrinen Modellsystem, exprimiert. Nach Transfektion dieser Zellen mit einem geeigneten Chymasekonstrukt zeigte sich in der Immunfluoreszenz eine Sortierung der exprimierten Chymase in Zymogengranula der AR42J-Zellen. Durch spezifische Antikörper konnte ich auch die PPIB eindeutig im 2D-Immunoblot der Wash-Fraktion und nach Granulasubfraktionierung in den Membranfraktionen detektieren. Andere ER-residente Chaperone wurden kaum bzw. nicht in den Zymogengranulafraktionen identifiziert. Quantitative PCR-Studien wiesen auch für die PPIB im exokrinen Pankreas eine Abhängigkeit der Transkriptionsrate vom Fütterungsverhalten der Tiere nach, was die Ergebnisse der Lokalisationsstudien stützt. Eine potentielle Funktion der granulären PPIB könnte in der Aufrechterhaltung der Konformation bestimmter Verdauungsenzyme liegen. Dies könnte Einfluß auf die autokatalytische Aktivierung dieser Enzyme haben. Eine weitere Funktion könnte in der Sortierung der Zymogene liegen. Interessanterweise können die in dieser Arbeit näher charakterisierten Proteine (Chymase, PPIB, CEL und RNAse A) alle potentiell mit Proteoglykanen interagieren und stützen durch ihre starke Assoziation mit der Zymogengranulamembran die Hypothese der submembranösen Granulamatrix. Der Fokus nachfolgender Experimente soll auf der weiteren Identifizierung neuer Komponenten dieser Matrix sowie in der funktionellen Analyse der im Rahmen dieser Arbeit analysierten Proteine liegen