Gewinnung und Modifikation von Flavonoiden in Mikroorganismen

Flavonoide sind eine im Sekundärstoffwechsel der Pflanze sehr bedeutende Stoffklasse und gewinnen zunehmend an Bedeutung in Pharmazie und Lebensmittelindustrie. Diese Arbeit sollte dazu dienen, verschiedene Systeme zur Herstellung von Flavonoiden zu optimieren. So sollte ein System zur Gewinnung glucuronidierter Flavonoide erstellt werden. Dazu schien die humane UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) geeignet, da sie in der Lage ist verschiedene Flavonoide zu metabolisieren (Tukey und Strassburg 2000). In dieser Arbeit konnte ein Test etabliert werden, mit dem mit (käuflicher) UGT1A1 die Flavonoide Kämpferol, Apigenin, Genistein und Daidzein teils zu mehreren verschiedenen Produkten glucuronidiert wurden. Zusätzlich wurde auch das künstliche Substrat Octylgallat und ein Chalkon (Xanthohumol) umgesetzt. Versuche, die UGT1A1 in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) und Nicotiana benthamiana zu exprimieren, scheiterten. Erfolgreich war dagegen die Expression im Pichia pastoris-System. In anschließenden Tests war Aktivität der UGT1A1 nachweisbar, die aber nicht ausreichend für größere Synthesen war. Für künftige Expressionsversuche sollten die Bedingungen weiter optimiert werden. Isoflavone werden in einer Zweischrittreaktion aus Flavanonen (z.B. Naringenin) gebildet (Steele et al. 1999, Akashi et al. 2005). Die beiden dafür benötigten Enzyme Isoflavonsynthase (IFS1) und 2-Hydroxyisoflavanondehydratase (HIDH) konnten in einem S. cerevisiae-Stamm funktionell exprimiert werden. Markiertes Genistein wurde dabei aus (2S)- [4a,6,8- 14C]Naringenin in einem Reaktionsansatz gewonnen. In Biotransformationen, denen unmarkiertes Naringenin zugesetzt wurde, war nach anschließender Säurezugabe ebenfalls Genistein nachweisbar. Verschiedene Flavonoide wurden enzymatisch aus [14C]-2-Malonyl-CoA und Coumaroyl-CoA hergestellt. So gelang es radioaktiv markiertes Naringenin, Eriodictyol, Kämpferol, Dihydroquercetin und Dihydrokämpferol im größeren Labormaßstab und hoher Reinheit zu gewinnen. Für die Optimierung von Biotransformationen sollte ein S. cerevisiae-Stamm, in dem die Flavonsynthase I (FNS I) aus Petersilie erfolgreich exprimiert wird (Martens et al. 2001), genutzt werden. Bei diesem Enzym handelt es sich um eine 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase, die die Umwandlung von Flavanonen zu Flavonen katalysiert. Neben Naringenin erwiesen sich Hesperetin, Eriodictyol, Homoeriodictyol, Pinocembrin und Liquiritigenin als geeignete Substrate für die Bildung der jeweiligen Flavone. Neben den positiven Auswirkungen auf den relativen Umsatz von Luftzufuhr, Zugabe der für die FNS I benötigten Cofaktoren und Erhöhung der Temperatur auf 37 °C, zeigten sich im Standardansatz zusätzlich positive Effekte durch Lösen des Substrates in Aceton. Durch Erhöhung der Inkubationsdauer konnte die größte relative Umsatzrate bei einer Temperatur von 30 °C und Zugabe von Naringenin gelöst in DMSO erzielt werden. Das Produkt konnte dann mittels HSCCC zu 98 % gereinigt werden. So konnte ein System etabliert werden in dem relativ einfach und effizient Flavone synthetisiert werden können. Zusätzlich sind die Ergebnisse auch übertragbar auf andere Enzyme (z.B. CytP450-Monooxygenasen). Beim Einsatz von glucosidierten Flavonoiden (Naringenin-7-O-glucosid) in Biotransformationen zeigte sich, dass die Hefe über endogene Glucoidasen verfügen muss. Da diese störend für Biotransformationen mit z.B. Glucosyltransferasen sein könnten, wurde nach diesen gesucht, um sie im besten Falle ausschalten zu können. Zehn putative Glucosidasen (BGL2, EXG1, SPR1, YIR007W, SUC2, YGR287C, YJL216C, YIL172C, DSE 2 und CWH41), wurden ausgewählt und exprimiert. In anschließendem Enzymtest konnten drei den α- (YGR287C, YIL172C und YJL216C) drei weitere den β-Glucosidasen (EXG1, SPR1 und YIR007W) zugeordnet werden. Die relevanten β-Glucosidasen zeigten Präferenzen für die 7-O und 4´-O-Glucoside der Flavanone, Flavone, Flavonole und Isoflavone. Ähnliche Präferenzen zeigt eine humane cytosolische β Glucosidase (hCBG, Berrin et al. 2002, 2003). Mutationen die in hCBG zur Verringerung der Aktivität führten, konnten aufgrund von Sequenzähnlichkeiten auch erfolgreich bei EXG1 und SPR1 eingeführt werden. Beim Test der Mutantenstämme für EXG1, SPR1 und YIR007W zeigte sich der Mutantenstamm EXG1 (YO5210) nicht mehr fähig, das eingesetzte Substrat Naringenin-7-O-glucosid zu metabolisieren. Auch in Biotransformationen von Naringenin-7-O-glucosid in FNS I oder FHT transformierten knockout-Hefestamm YO5210 war keine Umwandlung mehr detektierbar. Somit war ein Hefesystem gefunden worden, in dem in der Zukunft Flavonoidglucoside hergestellt werden könnten, ohne dass die angehängte Glucose durch endogene Glucosidasen abgespalten wird