O PAPEL DOS RECETORES DE ADENOSINA A2A NA MIGRAÇÃO DE NEURÓNIOS CORTICAIS PRINCIPAIS

Tese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, ramo de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de CoimbraNeuronal migration is a fundamental step during brain development. Indeed, the impairment of neuronal migration is one of the major causes of cortical malformation, which has been associated with several neurological and psychiatric disorders. Therefore, it is of upmost importance to unravel the mechanisms driving neuronal migration. In this regard, it was recently shown that adenosine type 2A receptor (A2AR) controls interneuron migration and insertion into the hippocampal circuitry. The work developed during this thesis aimed to evaluate if A2AR is also involved in the migration of cortical principal neurons. For that purpose, it was first evaluated the impact of the genetic deletion (A2AR-KO) or the pharmacological blockade of A2AR on mice cortical neurons migration during embryonic development. In comparison to their wild-type littermates, embryos lacking the A2AR showed impaired migration of cells labelled with BrdU at embryonic day 14.5 (E14.5) and traced at E17.5. Similarly, embryos exposed to the A2AR antagonist SCH58261 (daily 0.1mg/kg intraperitoneal (i.p.) injection in pregnant females from E13.5 to E16.5) displayed impaired migration when compared with embryos exposed to vehicle. This should be due to A2A receptors expressed by migratory neurons since in utero electroporation (IUE) of a plasmid encoding shRNA specific for A2AR (E14.5-E17.5) also impaired migration. The impairment of neuronal migration occurs mostly in the intermediate zone (IZ), where it was observed an accumulation of neurons. Nowadays, it is well-known that there are two fundamental steps for neurons at the IZ to be able to proceed their migration into the cortical plate (CP). It is required a transition from a multipolar to a bipolar shape, followed by the establishment of an axon-like leading process. Accordingly, in cultured mice cortical neurons, it was found that the pharmacological blockade of A2AR with the selective antagonist SCH58261 (50 nM) from day in vitro 0 (DIV0) leads not only to a reduction of the number of axons (SMI-31 positive neurites) but also of their length, analysed at DIV3. This was also appraised in vivo, as it was observed that the knockdown of A2AR led to an impairment of both neuronal polarization and axonal elongation in migratory neurons as well. Furthermore, it was also observed a similar impairment of cell migration in the CD73-KO mice, which lacks the ecto-5'-nucleotidase (e-5NT) that converts extracellular AMP into adenosine, indicating that the adenosine that is activating the A2AR derives from the extracellular catabolism of ATP. This is further heralded by the observation of immunoreactivity for the vesicular nucleotide transporter (VNUT) in mice developing cortex at E13.5 and E17.5. Altogether, these results show that A2A receptors activated by ATP-derived adenosine are involved in the migration of cortical principal neurons, in particular for the transition from the IZ into the CP by controlling the establishment of neuronal polarity and axonal elongation. In order to determine if the ability of A2A receptors to control axon formation is selective or not to cortical neurons, it was performed the same evaluation in cultured rat hippocampal neurons. It was found that the pharmacological activation of A2AR with the selective agonist CGS21680 (30 nM) induced the formation of abnormal secondary axons and neither the blockade or activation of A2A receptors interfered with the formation of the normal axon. These results show that A2AR is also able to control axon formation in hippocampal neurons. In contrast to the observed in cortical cells, the pharmacological blockade of A2A receptors did not inhibit axon formation of rat hippocampal neurons, but instead it is the activation of these receptors that interfered with axon formation, inducing the formation of aberrant secondary axons. Thus, there is a remarkable difference in the control of axon formation by A2AR in cortical and hippocampal neurons. While in cortical neurons there is a tonic regulation of axon formation by A2AR, in hippocampal neurons these receptors are not required for the normal formation of the axon. Furthermore, preliminary results showed that this should be attained by a modulation of collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) phosphorylation, a microtubule-associated protein that plays a crucial role in neurodevelopment, either in axon specification, guidance and outgrowth, and in cortical principal neuron migration. In contrast with the peripheral nervous system (PNS), which demonstrates a remarkable axonal regeneration ability, in the adult mammalian central nervous system (CNS) it is notorious that, after injury, damaged axons are mostly unable to regenerate, leading to the impairment of normal function. Therefore, the comprehension of the differences between those two systems may provide novel potential therapeutic strategies for axon repair. In that sense, during this work it was also explored the role of purinergic receptors in nerve regeneration, in particular the metabotropic P2Y1 receptor (P2Y1R) and A2AR, since it is expected a rapid increase in extracellular ATP levels and its metabolites upon nerve injury. There are systems that have the capacity to self-regenerate after injury, being excellent models to comprehend the mechanisms underlying regeneration. Of these, the sciatic nerve lesion represents a commonly used approach to evaluate naturally occurring mechanisms of regeneration after damage and here, it was used to address the involvement of purinergic receptors during this process. The preliminary results obtained reveal that in the presence of MRS2500 (0.8 mM), a P2Y1R antagonist, it was observed a decrease of 50.6% in the number of myelinated fibres recovered. On the other hand, the antagonism of A2AR did not significantly modify the number of regenerated myelinated fibres. Though, it remains to elucidate if it is the regeneration or the myelination of fibres that are being compromised after P2Y1R blockade. To answer this question, it is necessary to evaluate the number of demyelinated and non-myelinated fibres as well. Altogether, this thesis provides evidences supporting the involvement of A2A receptors in the migration of cortical principal neurons through the modulation of neuronal polarization and axonal elongation, two cellular events fundamental for neuronal migration, most likely through the de-repression of CRMP-2. The impact of this work may be beyond the contribution to the understanding of the physiology of development, since caffeine, the psychoactive drug most consumed in the world, is an antagonist of A2A receptors.A migração neuronal é um passo fundamental no desenvolvimento cerebral. A diminuição ou bloqueio da migração neuronal são algumas das principais causas de má formação cortical e têm vindo a ser associadas a diversas patologias neurológicas e psiquiátricas. É, portanto, importante desvendar os mecanismos que regem a migração neuronal. Recentemente foi demonstrado que os recetores de adenosina do tipo 2A (A2AR) controlam a migração e inserção dos interneurónios na rede de neurónios do hipocampo. O trabalho que deu corpo a esta tese visou avaliar se os A2AR desempenham também um papel na migração dos neurónios corticais principais. Para este fim, tentou avaliar-se em primeiro lugar o impacto da eliminação genética (A2AR-KO) ou o bloqueio farmacológico dos A2AR nos neurónios corticais principais de murganho durante o desenvolvimento embrionário. Quando comparados com a restante ninhada wild-type, os embriões sem expressão dos A2AR apresentaram alteração da migração celular em células marcadas com BrdU ao dia embrionário 14.5 (E14.5) e analisadas a E17.5. De igual modo, embriões expostos ao antagonista dos A2AR, SCH58261 (injeção intraperitoneal (i.p.) de 0.1mg/kg/dia em fêmeas gestantes desde E13.5 a E16.5), apresentaram alteração da migração neuronal quando comparados com embriões expostos apenas ao veículo. Provavelmente, isto ocorre devido aos A2AR expressos pelos neurónios em migração, já que a eletroporação in utero (IUE) de um plasmídeo que expressa para um shRNA seletivo para os A2AR (E14.5-E17.5) também afetou a migração. Esta alteração na migração neuronal ocorreu principalmente na zona intermédia (IZ), onde se observou uma acumulação neuronal. Atualmente, sabe-se que existem dois passos fundamentais para que os neurónios na IZ prossigam a sua migração para a placa cortical (CP). É necessária uma transição de uma forma multipolar para uma bipolar, seguida do aparecimento de um prolongamento similar ao que dá origem ao axónio. Do mesmo modo, em culturas de neurónios corticais de murganhos foi observado que o bloqueio farmacológico dos A2AR com o antagonista seletivo SCH58261 (50 nM), desde o dia in vitro 0 (DIV0), conduz não só à redução do número de axónios (neurites positivas para SMI-31) como também do seu comprimento, avaliado a DIV3. Observações in vivo levaram a conclusões similares, uma vez que se observou que a eliminação dos A2AR conduziu a uma alteração quer da polarização, quer do alongamento axonal em neurónios em migração. Adicionalmente, foi observada uma alteração na migração celular em murganhos CD73-KO, que não expressam a enzima ecto-5'-nucleotidase (5'-NT) que converte AMP em adenosina, o que indica que a adenosina que ativa os A2AR provêm do catabolismo extracelular do ATP. Esta hipótese é apoiada pela observação de imunoreactividade para o transportador nucleotídico vesicular (VNUT) a E13.5 e a E17.5 no córtex de murganhos em desenvolvimento. Em conjunto, estes resultados demonstram que os recetores A2A ativados pela adenosina derivada do ATP estão relacionados com a migração dos neurónios corticais principais, em particular durante a transição da IZ para a CP, através da regulação da polaridade neuronal e alongamento axonal. Para determinar se a capacidade dos A2AR para controlar a formação do axónio é seletiva dos neurónios corticais, o mesmo tipo de análise foi efetuada em culturas de neurónios de hipocampo de murganho. Foi observado que a ativação farmacológica dos A2AR com o agonista seletivo CGS21680 (30 nM) induziu a formação de axónios secundários aberrantes, mas nem o bloqueio nem a ativação dos A2AR interferiram com a formação do axónio principal. Estes resultados mostram que os A2AR estão também envolvidos no controlo da formação de axónios nos neurónios do hipocampo. Ao contrário do observado nas células corticais, o bloqueio farmacológico dos A2AR não inibiu a formação de axónios nos neurónios do hipocampo de murganho, mas a ativação destes recetores alterou a formação axonal, induzindo o aparecimento anómalo de axónios secundários. Desta forma, existe uma diferença notável no controlo mediado pelos A2AR na formação de axónios nos neurónios corticais e do hipocampo. Enquanto que, em neurónios corticais há uma regulação tónica da formação de axónios pelos A2AR, em neurónios do hipocampo estes recetores não são necessários à formação do axónio principal. Adicionalmente, resultados preliminares mostram que esta formação pode ser conseguida pela modulação da fosforilação da proteína mediadora de resposta da colapsina-2 (CRMP-2), uma proteína associada aos microtúbulos que desempenha um papel crucial no neuro desenvolvimento, tanto na especificação, condução e crescimento do axónio, como na migração de neurónios corticais. Em contraste com o sistema nervoso periférico (SNP), que revela uma marcada capacidade de regeneração axonal, no sistema nervoso central (SNC) do mamífero adulto é notório que, após lesão, os axónios danificados são predominantemente incapazes de regenerar, ficando funcionalmente comprometidos. A compreensão das diferenças entre estes dois sistemas pode, portanto, permitir identificar estratégias terapêuticas inovadoras para a reparação dos axónios. Desta forma, durante este trabalho foi também explorado o papel dos recetores purinérgicos na regeneração nervosa, em particular o recetor metabotrópico P2Y1 (P2Y1R) e o A2AR, uma vez que se antecipa um aumento súbito dos níveis de ATP extracelular, bem como dos seus metabolitos após lesão nervosa. Os sistemas com capacidade regenerativa apresentam-se como modelos de excelência para compreender os mecanismos subjacentes a essa regeneração. De entre eles, a lesão do nervo ciático é um método comum para avaliar os mecanismos de regeneração despoletados pelo dano, que foi usado neste trabalho para abordar o envolvimento dos recetores purinérgicos nesse processo. Os resultados preliminares obtidos demonstraram que na presença de MRS2500 (0.8 mM), um antagonista dos P2Y1R, ocorreu uma diminuição de 50.6% no número de fibras mielinizadas recuperadas. Por outro lado, o antagonismo dos A2AR não revelou diferenças estatisticamente significativas no número de fibras mielinizadas regeneradas. É necessário ainda determinar se o bloqueio dos P2Y1R está a comprometer a regeneração ou a mielinização das fibras. A resposta a esta questão requer a avaliação do número de fibras desmielinizadas e não-mielinizadas. No seu conjunto, esta tese fornece indícios que suportam o envolvimento dos A2AR na migração dos neurónios corticais principais através da modulação da polarização neuronal e alongamento axonal, dois processos celulares fundamentais para a migração neuronal, muito provavelmente pela de-repressão da CRMP-2. O impacto deste trabalho pode ainda estender-se além da compreensão da fisiologia do desenvolvimento, dado que a cafeína, a substância psicoativa mais consumida no mundo, é um antagonista dos A2AR