Mesures de l'activité de l'enzyme NADPH oxydase du neutrophile (NOX2) en système compartimenté et mise au point de protéoliposomes géants pour l'étude concertée de son assemblage et de sa fonction

The membrane multimeric metalloenzyme NADPH oxidase (NOX2) from neutrophil is implied in several essential physiological functions including the immune response, by strongly contributing to the destruction of pathogens or other invaders of the human body. Physiological functions of NOX2 are fulfilled by its chemical function of catalyst of superoxide anion production via the monoelectron dioxygen reduction on one face of the membrane, simultaneously to the NADPH bielectron oxidation on the other face of the membrane. Studies of biochemical features of the whole enzyme, including its activation and regulation mechanisms linked to the macromolecular assembly, is done in vitro by using neutrophil membrane fractions (MF), which are small vesicles containing NOX2, and by using the recombinant cytosolic proteins (p67phox, p47phox, p40phox and Rac1/2) essential for its function, in presence of an activator molecule such as arachidonic acid (AA), a fatty acid. The historical technics to measure the NOX2 enzyme activity is the superoxide anion detection by a protein probe, the Cytochrome c (Cytc). In this system, NOX2 catalyses the production of superoxyde anions towards the inside of MF vesicles and the superoxide anions are detected outside. In correlation with literature, the present research shows that the enzyme activity determined via the detection of superoxide anions by the Cytc is lower that the activity determined from NADPH consumption measurement. The source of the problem includes potentially constraints of membrane permeability, of membrane and protein structure, of protein-protein and protein-membrane interactions, of the relevance of the probe and of secondary reactions. These hypotheses have been tested by various means including notably global kinetics measurements and NOX2 activity measurements in various conditions with three different observables (NADPH, Cytc, dioxygen), in presence of detergent or ionophore, by varying temperature, Cytc concentration, substrate concentration, AA concentration or still preincubation time. Secondary reactions existence has also been probed by electrochemistry. This study shows that the measurement of the superoxide anion production is limited by membrane permeability and secondary reactions and that the usual Cytc concentration is non-saturating, and unexpectedly that the MF catalyses the disproportionation of hydrogen peroxide by a thermolabile component. It is currently very hard to measure simultaneously the NADPH oxidase activity and the assembly of the whole complex. The second objective of my thesis was consequently to develop giant unilamellar vesicles (GUV) with NOX2 integrated into their membranes. This to be able to observe the complex assembly by fluorescence microscopy and simultaneously to measure the superoxide anion production by electrochemistry under microscope. The development of GUV with MF at the membrane (MF-GUV) has been successful, but without confirmation of NOX2 integration in the GUV membrane. The assembly of cytosolic proteins on the external face of the membrane was studied on GUV and on MF-GUV, leading to the discovery that membrane anchor of these proteins is possible only in presence of AA and is mostly due to lipids, NOX2 playing a minor role. Study of interactions between cytosolic proteins and internal face of the GUV membrane must be optimised. It was possible in GUV to detect qualitatively NOX2 activity by electrochemistry and by fluorescence, (Amplex-Red), but this point should still be optimised.La métalloenzyme multimérique membranaire NADPH oxydase du neutrophile (NOX2), est impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques vitales incluant la réponse immunitaire, en contribuant fortement à la destruction des pathogènes ou autres envahisseurs du corps humain. Les fonctions physiologiques de NOX2 sont assurées par sa fonction chimique de catalyseur de la production d’anions superoxyde via la réduction monoélectronique du dioxygène à une face de la membrane, simultanément à l’oxydation biélectronique du NADPH à l’autre face de la membrane. L’étude des caractéristiques biochimiques de l’enzyme entière, incluant ses mécanismes d’activation et de régulation, en lien avec l’assemblage macromoléculaire, est réalisée in vitro en utilisant des fractions membranaires de neutrophile (FM), petites vésicules contenant NOX2, ainsi que les protéines cytosoliques recombinantes (p67phox, p47phox et Rac1/2) indispensables à sa fonction, en présence d’une molécule activatrice comme l’acide arachidonique (AA), un acide gras. La technique historiquement privilégiée de mesure de l’activité enzymatique de NOX2 implique la détection des anions superoxyde par une sonde protéique, le Cytochrome c (Cytc). Dans ce système, les anions superoxyde, dont la production est catalysée par NOX2 vers l’intérieur des vésicules de FM, sont détectés à l’extérieur. En corrélation avec la littérature, ces recherches montrent que l’activité enzymatique déterminée via la détection des anions superoxyde par le Cytc est plus faible que lorsqu’elle est déterminée via la mesure de la consommation du NADPH. L’origine du problème inclut potentiellement des contraintes de perméabilité membranaire, de structure de la membrane et des protéines, d’interactions des protéines entre-elles et avec les lipides membranaires, de pertinence de la sonde utilisée et de réactions secondaires. Ces hypothèses ont été testées par différents moyens incluant notamment des mesures de cinétiques globales et de l’activité de NOX2 dans différentes conditions et avec différentes observables (NADPH, Cytc, dioxygène), en présence de détergent ou d’ionophore, en faisant varier la température de mesure, la concentration en Cytc, la concentration en substrat, la concentration en AA ou le temps de préincubation. La présence de réactions secondaires a également été testée par électrochimie. Cette étude montre que la mesure de la production des anions superoxyde est limitée par la perméabilité membranaire et par les réactions secondaires. Il a aussi été mis en exergue que la concentration en Cytc usuelle pour ces mesures n’est pas saturante et de façon inattendue que les FM catalysent intrinsèquement la dismutation du peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un composant thermolabile. Il est aujourd’hui très compliqué de mesurer de façon concomitante l’activité de la NADPH oxydase et son assemblage. Le deuxième objectif de cette thèse était donc la mise au point de vésicules géantes unilamellaires (GUV) intégrant NOX2 dans leur membrane, ce qui permettrait d’observer par microscopie de fluorescence l’assemblage du complexe NADPH oxydase et de simultanément mesurer la production des anions superoxyde par électrochimie sous microscope. La formation de GUV possédant des FM (FM-GUV) à leur membrane est un succès mais sans confirmation de l’intégration de NOX2 à la membrane des GUV. L’assemblage des protéines cytosoliques à la face externe de la membrane a été étudié sur GUV et sur FM-GUV, ce qui a permis de montrer que l’ancrage membranaire de ces protéines est possible seulement en présence d’AA et dû de façon prépondérante aux lipides et que NOX2 joue un rôle minoritaire. L’étude des interactions entre les protéines cytosoliques et la face interne de la membrane des GUV reste à optimiser. Il a été possible de détecter en GUV qualitativement une activité de NOX2 par électrochimie et par fluorescence (Amplex-Red), mais ce point reste aussi à optimiser