Diseño y síntesis de receptores derivados de carbohidratos: Ciclodextrinas multivalentes, podandos y ciclotrehalinas. Evaluación de su capacidad de complejación y reconocimiento por lectinas

Las células presentan en su superficie oligosacáridos ramificados unidos de modo covalente a lípidos (glicolípidos) o proteínas (glicoproteínas). La porción glucídica de estos glicoconjugados codifica una información biológica específica determinada por su estructura tridimensional que puede ser reconocida por proteínas llamadas lectinas. Las interacciones entre los carbohidratos y las lectinas son de importancia fundamental para la comunicación celular. Están relacionadas con procesos biológicos como la defensa inmunológica, la replicación vírica, la adhesión celular, la inflamación, la transducción de señales bioquímicas y los procesos de adhesión de agentes microbianos a la superficie de las células huésped potenciales. La toma de conciencia de la función que desempeñan los carbohidratos como portadores de información biológica ha desencadenado un importante esfuerzo investigar dirigido a la elucidación de los mecanismos que intervienen en su reconocimiento por lectinas, tanto a nivel macromolecular como atómico. Las interacciones carbohidrato-proteína, en contraste con las interacciones proteína-proteína, presentan constantes de afinidad débiles en el rango milimolar o incluso micromolar y, en general, requieren la existencia de numerosos contactos entre carbohidratos que se encuentran agrupados en la superficie celular (“clusters”) y receptores protéticos que contienen múltiples regiones de reconocimiento (“carbohydrate recognition domains; CRDs”) para alcanzar afinidades biológicamente útiles. Esta situación da lugar a la aparición de fuerzas asociativas cooperativas que conducen a afinidades superiores a las que serían predecibles de la sima de las interacciones individuales. La importancia de este fenómeno, conocido como “efecto cluster”, fue puesta de manifiesto por primera vez por Y.C. Lee en sus trabajos sobre el receptor Gal/GalNAc de la asialoglicoproteína de las células del hígado. Utilizando neoglicoconjugados sintéticos, demostró que un aumento lineal en el número de los motivos de reconocimiento monosacarídicos conducía a un incremento logarítmico en la eficacia de la asociación. Desde entonces el diseño y la síntesis de nuevos neoglicoconjugados multivalentes capaces de interferir con los procesos de reconocimiento carbohidrato-proteína a nivel celular es un campo muy activo en glicobiología con aplicaciones en la preparación de vacunas, inmunomoduladores, antiinflamatorios, agentes para inmunodiagnosis, transportadores de medicamentos dirigidos a células específicas, soportes de afinidad, inhibidores de la adhesión celular y bacteriana y sondas utilizadas en radioimagen. Los carbohidratos difieren de las otras clases de biomoléculas en el amplísimo repertorio estructural que puede generarse a partir de un número reducido de sus elementos constituyentes (monosacáridos), lo que les hace especialmente adecuados para la transferencia de información biológica. Para que la transmisión de esta información sea eficaz, el proceso de reconocimiento por receptores específicos debe tener un alto grado de precisión. El estudio de como los carbohidratos son reconocidos por lectinas y de cuales son los factores que determinan la especificidad y la afinidad de la asociación a nivel atómico, es consecuentemente, un tema de gran interés. Las informaciones más detalladas de que se dispone en este sentido proceden del estudio por difracción de rayos X de cristales de complejos de lectinas y carbohidratos. Estos trabajos ponen de manifiesto la existencia simultánea de interacciones por enlace de hidrógeno y fuerzas de van de Waals, incluyendo interacciones entre caras hidrófobas del azúcar y aminoácidos aromáticos. La espectroscopía de RMN ha permitido ampliar esta información a sistemas en disolución. En cualquier caso, los sistemas naturales resultan demasiado complejos para permitir extraer conclusiones sobre aspectos tales como la importancia relativa de los diferentes tipos de interacciones implicadas en el reconocimiento de carbohidratos o la identificación de motivos individuales de reconocimiento. Estas cuestiones se han abordado mediante el uso de receptores más sencillos que permitan estudiar las interacciones supramoleculares entre carbohidratos y moléculas orgánicas simples. Las ciclodextrinas (CDs), ciclooligosacáridos formados por unidades de glucosa unidas mediante enlaces glicosídicos α(1→4), han desempeñado un papel fundamental en este sentido. Los derivados que incorporan 6, 7 y 8 unidades de glucopiranosilo (α, β y γ-CD, respectivamente), son comercialmente asequibles y presentan una estructura tridimensional troncocónica toroidal, con una cavidad relativamente hidrófoba que permite la formación de complejos de inclusión con moléculas apolares en disolución acuosa. Su estructura ha inspirado el diseño y la síntesis de otros oligosacáridos como receptores artificiales para el estudio de interacciones supramoleculares. Alternativamente se han desarrollado receptores basados en estructuras aromáticas y peptídicas capaces de reconocer azúcares mediante enlaces no covalentes. Además de proporcionar información fundamental sobre los procesos de reconocimiento biológico, estos trabajos han desembocado en el desarrollo de nuevos biosensores, fármacos y sistemas de transporte. Los objetivos planteados en esta Tesis se enmarcan en este contexto general y persiguen, por una parte, profundizar en el conocimiento de las interacciones supramoleculares que implican carbohidratos y, por otra, combinar la posibilidad de interacción de estas biomoléculas con receptores celulares y con otras moléculas orgánicas en el diseño de sistemas de transporte específico de fármacos. En la primera parte de esta memoria se recogen los resultados relativos a la síntesis de neoglicoconjugados multivalentes derivados de la β-ciclodextrina, la determinación preliminar de su poder de solubilización de fármacos usando el anticanceroso Taxotère® como referencia y la evaluación de la capacidad de reconocimiento por una lectina específica (concanavalina A, Con A) para el caso de los conjugados que incorporan ligando derivados de manosa como marcador celular. En la segunda parte se describe la preparación de receptores artificiales de tipo podando que incorporan carbohidratos diseñados para el estudio de interacciones por enlace de hidrógeno, la influencia de los aspectos estructurales y conformacionales en su asociación con ligandos aceptores de tipo carboxilato y monosacarídico y la síntesis de una nueva familia de ciclooligosacáridos (ciclotrehalinas) adecuados para el estudio de interacciones en medio acuoso. CONCLUSIONES 1. La adición nucleófila de derivados de β-CD incorporando uno o siete grupos amino en posición primaria a glicosil isotiocianatos peracetilados proporciona una metodología eficiente de acceso a conjugados mono- y heptaantenados, respectivamente. La reacción de acoplamiento se completa, en general, en pocos minutos en piridina (conjugados monovalentes) o en acetona/agua a pH 8 (conjugados heptavalentes) y la purificación del aducto puede efectuarse mediante cromatografía en columna de gel de sílice incluso para el caso de estructuras 21-sacarídicas. La etapa subsiguiente de desacetilación transcurre con rendimiento cuantitativo. Además, el procedimiento es compatible con isotiocianatos unidos a grupos alquilo o arilo. Todos los neoglicoconjugados preparados mostraron una solubilidad en agua entre 25 y 40 veces superior a la de la β-ciclodextrina canónica, incrementan la solubilidad en agua del Taxotère, un potente antimitótico derivado del taxol y mostraron una significativa disminución (en torno al 75%) en su carácter hemolítico en comparación con la β-ciclodextrina comercial lo que los hace buenos candidatos como sistemas de transporte específico de medicamentos. 2. La anomerización parcial observada para las α- y β-D- manopiranosiltioureas bajo las condiciones básicas de desacetilación de Zemplén puede evitarse efectuando la desprotección a 0º C, lo que permite obtener compuestos desprotegidos configuracionalmente estables en ausencia de base. La aplicación de esta metodología a derivados aminados de β-ciclodextrina permite obtener los correspondientes conjugados manosa-(tiourea)-β-Cd, adecuados para estudios de asociación con la lectina Concanavalina A. 3. Los estudios de afinidad de los conjugados manosa-(tiourea)-β-CD mono y heptavalentes hacia la Concanavalina A, siguiendo el protocolo ELLA, indican que la lectina no muestra selectividad anomérica entre ligando de α- o β-D- manopiranosiltioureas lo que excluye una disminución en la afinidad debida a posibles procesos de anomerización. En cambio, los derivados con ligandos de manosa unidos a través de la posición primaria (C-6) presentan una afinidad mucho menor y no son adecuados para la vectorización de fármacos. Aunque la presencia del puente intersacarídicos de tiourea origina una ligera pérdida de afinidad por la lectina en comparación con los enlaces O-glicosídicos, este efecto queda compensando en los conjugados monovalentes por la existencia de interacciones estabilizantes debidas a la presencia del anillo de ciclodextrina. En el caso de los aductos persustituidos, a pesar del aumento de la densidad de ligando manosilado, se observa una pérdida de afinidad por la lectina debido, probablemente a un acceso más impedido al sitio activo. 4. Para la preparación de conjugados ciclodextrina-glicodendrímeros se han examinado las metodologías sintéticas convergente y divergente teniendo como etapa clave en ambos casos la formación de un grupo tiourea. Se han empleado como elementos de base la monoamina de β-CD, el cloruro de 6-azidohexanoilo como espaciador y el 2-amino-1,3-di-terc-butoxicarbonilaminopropano como elemento de ramificación. Como motivos de reconocimiento se han utilizado el 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-manopiranosil isotiocianato y un marcador manosilado trivalente. Con estas unidades de base hemos preparado una serie de neoglicoconjugados manosilados di, tri, tetra, y hexavalentes y hemos evaluado su afinidad por la Con A utilizando el protocolo ELLA. La afinidad por la lectina aumenta, en general, con la valencia. La presencia del anillo de ciclodextrina origina interacciones adicionales con la proteína que aumentan la afinidad. Es notable que la afinidad de la asociación ligando manosilado-Con A aumenta fuertemente con la presencia de grupos de tres subunidades de manosa. 5. SE ha optimizado la autocondensación de isotiocianato para obtener tioureas simétricas y se ha empleado esta metodología para la preparación de receptores bidentados por enlace de hidrógeno derivados de azúcar. El análisis de la capacidad de complejación de estos receptores frente a carboxilatos indica que esta es relativamente independiente de las propiedades conformacionales del receptor, es decir, de la proporción de confórmero activo, y parece depende más de la naturaleza de los sustituyentes en el sitio de unión y de las interacciones intramoleculares que puedan competir con la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares. 6. Se han estudiado las propiedades de complejación de receptores politioureidos derivados de carbohidrato frente a huéspedes aniónicos y neutros, tomando como modelos el anión glutarato y el octil β-D-glucopiranósido. Hemos escogido sistemas con simetría C2V para promover interacciones de tipo cooperativo y facilitar el análisis estructural. En el diseño se han empleado segmentos complementarios de ambos huéspedes (p-xililen bis(tiourea)) y se han incorporado otros segmentos (m-xililen bis(tioirea)) que favorezcan la creación de una cavidad más profunda. En el caso de ligando aniónico, donde las interacciones por enlace de hidrógeno son fuertes, la estequiometría las Kas de los complejos resultaron fuertemente dependientes de la disposición de los motivos de reconocimiento en el receptor. Sin embargo, en el caso de ligando glicosídicos, donde las interacciones son débiles, la contribución a la energía de complejación debida a una superficie de contacto máxima es muy superior a la asociada al cambio de conformación entre los estados libre y enlazado del receptor. 7. La autocondensación de diisotiocianatos, en combinación con el acoplamiento de diisotiocianatos y diaminas derivadas de la trehalosa, constituye una estrategia muy conveniente de síntesis de macrociclos híbridos de trehalosa y tiourea (ciclotrehalinas) de diferentes tamaños. Esta familia de pseudooligosacáridos conservan las características esenciales de las CDs (alta simetría, solubilidad en agua y una cavidad relativamente hidrófoba). Se ha comprobado que la capacidad de inclusión de moléculas apolares dentro de la cavidad se conserva, midiendo Kas del orden de las descritas para las CDs. Sin embargo, al contrario que en estas, es la cara β del azúcar la dispuesta hacia el interior de la cavidad por lo que constituyen herramientas complementarias para el estudio de eventos de reconocimiento molecular que impliquen carbohidratos